Scientific journal

Advances in current natural sciences

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

Род Begonia L. является одним из крупнейших родов цветковых растений, в него входят около 1500 видов и тысячи декоративных гибридов и сортов [1]. Представители рода составляют одну из крупнейших систематических коллекций в фондовых оранжереях Центрального Сибирского ботанического сада СО РАН (около 300 таксонов), где проводится их углубленное изучение по различным научным аспектам. Нами исследуются биологические особенности представителей рода Begonia в оранжерейной культуре и интерьерах, их адаптивные возможности, лекарственные и фитонцидные свойства [2]. Факт обнаружения значительных количеств антоцианов, аскорбиновой кислоты, фенольных соединений в надземной части исследованных видов в ЦСБС позволяет рассматривать их в качестве источников средств лечебного и профилактического назначения, а также для использования в медицинском и экологическом фитодизайне [3]. В рамках научной работы, направленной на расширение коллекционного фонда растений из рода Begonia, нами разрабатывались способы размножения видов и их длительного поддержания ex vivo и in vitro. Ранее сообщалось о возможности введения бегоний в культуру in vitro с использованием разных типов эксплантов [4, 5]. Отмечено, что регенерационная способность более высокая у эксплантов генеративной сферы [4]. Регенерация происходила путем адвентивного побегообразования либо в каллусной культуре.

Цель работы – усовершенствовать методику размножения бегоний in vitro и ex vivo и изучить факторы, влияющие на длительное поддержание в коллекции данных таксонов.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования являлись поликарпические бегонии, имеющие различные жизненные формы и феноритмологические особенности развития, обусловленные экологическими условиями мест их естественного произрастания.

B. rockii из секции Platycentrum. Родина – Юго-восточная Азия. Корневищное растение. Ризомы удлиненные, приподнимающиеся над почвой на 10–12 см. Листья треугольно-яйцевидные, 2х8 см, темно-зеленые с белыми пятнами между главными жилками (рис. 1, а). Цветки однополые, белые, 4–5 см в диаметре. Цветет осенью. Произрастает под покровом леса, в ущельях, среди скал на высоте 700–800 м над уровнем моря.

B. sutherlandii из секции Augustia. Родина – Южная Африка. Травянистое, клубневое растение, с ярко выраженным периодом покоя, во время которого надземная часть отмирает. Листья асимметричные, зубчатые, зеленые. Размер листовой пластинки: 2х3 см. Цветки однополые, оранжевые, 2–3 см в диаметре. Цветёт летом (рис. 1, б). Произрастает как петрофит на влажных скалах, у водопадов или как эпифит на деревьях на высоте 900–1800 м над уровнем моря.

B. variegate из секции Coelocentrum. Родина – Вьетнам. Корневищное травянистое растение, побеги на 1/3 погружены в почву, апикальная часть побега приподнимается над землёй на 3–6 см. Листья размером 10х12 см, тёмно-зелёные, широкоовальные с тёмно-коричневыми полосами вдоль основных жилок, морщинистые (рис. 1, в). Цветки однополые, светло-зелёные, до 1 см в диаметре. Цветёт летом. Растёт на скалистых известняковых склонах или в пещерах, под покровом леса, на высоте 100–300 м над уровнем моря.

B. ‘Gloire de Lorraine’ является гибридом, полученным в результате скрещивания Begonia socotrana J.D. Hooker с Begonia dregei Otto end A. Dietrich. В природных условиях эти два вида растут в сезонном климате. B. ‘Gloire de Lorraine’ унаследовала некоторые черты от каждой из родительских форм: розовые цветки, зимнее время цветения – явные признаки B. socotrana, продолжительность цветения унаследована от B. dregei. В исследование сорт был включен благодаря обильному и продолжительному цветению в зимнее время, что является редким явлением в условиях закрытого грунта Западной Сибири (рис. 1, г).

В качестве материала для введения в культуру in vitro были использованы фрагменты цветков данных видов бегоний, находящиеся в соцветии в закрытом состоянии. Перед стерилизацией экспланты промывали проточной водой (15 мин), затем 1 % раствором фундазола в смеси с 3 % раствором жидкого мыла (30 мин). Экспланты помещали на модифицированную среду N6 (мN6), содержавшую 40 мг/л аденин сульфат, 3 % сахарозу, 0,6 % агар и регуляторы роста (варианты 2, 3, 4), а также на среду мN6 без регуляторов роста (вариант 1). Для роста и мультипликации побегов микроклоны переносили на среду МС, содержавшую 0,2 мг/л БАП. Для укоренения была использована среда Кнудсена без регуляторов роста. Время одного пассажа составляло 3 недели. Индукцию и культивирование эксплантов проводили при температуре 24 ± 2 °С, 16-часовом фотопериоде при искусственном освещении 40 мкмоль•м-2/сек-1. Эксперименты in vitro повторялись трижды, в каждом варианте было 30 эксплантов. Для создания феноспектров использовали данные 15-летних наблюдений не менее 10 растений каждого из 4 таксонов рода Begonia. Полученные результаты обрабатывали с помощью компьютерной программы Excel лицензионного пакета Microsoft Office 2007. В таблицах приведены средние арифметические и стандартные ошибки средних, статистически значимыми различия считали при р ≤ 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Для каждого из исследованных видов мы выделили некоторые экологические факторы, влияющие на их рост и развитие. У представителей тропического климата B. rockii и B. variegata нет выраженного периода покоя, что видно из феноспектра (рис. 2). Поэтому на их развитие оказывают влияние экзогенные факторы, в данном случае температура воздуха. При её понижении рост растений не прекращается, но заметно приостанавливается. Размножение этих бегоний в ЦСБС осуществляется делением корневищ и листовыми черенками. В условиях выращивания у B. variegata cемена не вызревают, а у B. rockii семена мы получаем, но их всхожесть низкая и составляет 20 %. Вегетативные части для размножения вышеописанных бегоний можно брать в любое время года. При соблюдении оптимального температурного и влажностного режима период получения диаспор из листовых черенков составляет у B. rockii 20–60 дней, а у B. variegatа – 50–150 дней. Самый короткий период формирования диаспор наблюдался в весенне-летний период, а наиболее продолжительный – в осенне-зимний. Другой способ размножения, позволяющий получить у данных видов за год 3–4 новых экземпляра, – это деление корневища. Для выращивания вышеописанных видов подобран субстрат, исходя из условий произрастания этих бегоний в природе. Он состоит из следующих компонентов: листовая земля, песок, торф в пропорции 2:1:1.

У B. sutherlandii вступление в состояние покоя жестко детерминировано эндогенной ритмикой: после цветения, даже при благоприятных микроэкологических условиях, происходит торможение ростовых процессов и отмирание надземной части (рис. 2). Растение несколько месяцев сохраняется в виде клубня. Поэтому для культивирования B. sutherlandii в коллекции ЦСБС были созданы условия, приближённые к таковым в местах естественного произрастания вида по водному и температурному режиму. Для культивирования таксона разработана водо- и воздухопроницаемая почвосмесь, состоящая из листовой земли, песка, мелкой гальки, торфа, сосновой коры в пропорции 2:1:1:1:1, не позволяющая загнивать корневой системе. Размножение данного вида проводилось путем черенкования побегов и выводковыми почками, т.к. семена при интродукции не завязываются, а размножение с помощью листовых черенков неэффективно. У ‘Gloire de Lorraine’ нет выраженного периода покоя: в самые жаркие месяцы лета растение продолжает вегетировать, но цветение прекращается (рис. 2). Наиболее эффективным агротехническим приёмом в летний период является обрезка растения на 2/3 и укоренение стеблевых черенков в течение 20–30 дней. Отмечено, что листовых черенков. Субстрат для выращивания данного сорта состоит из листовой земли, песка, торфа, мелкого керамзита в пропорции 2:1:1:0,5. Для выявления оптимальных сроков размножения бегоний как ex vivo, так и in vitro нами составлены феноспектры, в которых отражены ритмы развития вегетативной и генеративной сферы у исследованных таксонов (рис. 2). Из представленных феноспектров видно, что у B. sutherlandii и B. variegatа цветение наблюдается 4 летних месяца, самый короткий период цветения у B. rockii – 3 месяца, тогда как у B. ‘Gloire de Lorraine’ – ценного представителя зимнецветущих растений – цветение продолжается 10 месяцев.

Условные обозначения:

Рис. 2. Феноспектры изученных бегоний

Описанные выше бегонии относятся к разным феноритмологическим группам и являются модельными объектами для отработки методики микроклонального размножения.

При введении в культуру in vitro эксплантов, изолированных из вегетативных органов бегоний (листьев, черешков) отмечена их высокая контаминация, что требовало более жестких условий стерилизации по сравнению с флоральными эксплантами. Для получения стерильных эксплантов – фрагментов женских и мужских цветков бегоний, находящихся в соцветии в закрытом состоянии, были применены 2 варианта стерилизации:

1) 70 %-ный С2Н5ОН (30 сек) + 0,1 %-ный раствор HgCl2 (10 мин);

2) 0,1 % раствор AgNO3 (15 мин).

Выяснено, что наиболее оптимальным агентом для стерилизации фрагментов цветков бегоний, относящихся к 4 различным таксонам, является 0,1 % раствор AgNO3 (экспозиция 15 мин), при использовании которого жизнеспособность флоральных эксплантов достигала 86,6 %. Для индукции адвентивного побегообразования была выбрана среда N6 как наиболее универсальная для получения регенерантов бегоний из флоральных эксплантов. Процесс прямого морфогенеза побегов в культуре изолированных фрагментов цветков всех 4 генотипов бегоний более интенсивно происходил под действием 0,5 мг/л тидиазурона (ТДЗ), в сочетании с 0,5 мг/л бензиламинопурина (БАП) и 0,2 мг/л индолилмасляной кислоты (ИМК) (4 вариант среды мN6) (рис. 3, г). Количество эксплантов, образовавших адвентивные побеги, различалось в зависимости от генотипа и регуляторов роста, вносимых в питательную среду (табл. 2).

Зафиксированы единичные случаи индукции флорального морфогенеза некоторых бегоний при введении в среду мN6 0,2 мг/л цитокинина БАП (рис. 3, а, б). Пролиферации каллуса способствовало добавление в состав среды ТДЗ либо БАП в концентрации более 1 мг/л (рис. 3, в). В вариантах среды мN6 число регенерировавших побегов составило от 4 до 35. Авторами отмечено, что для лучшего роста и мультипликации побегов бегоний, полученных путем индукции адвентивных почек флоральных эксплантов, целесообразно заменять питательную среду мN6 с высоким содержанием макроэлементов на среду МС, включавшую более низкие дозы макроэлементов и цитокинина БАП (0,2 мг/л). Для укоренения была использована среда Кнудсена без регуляторов роста. Спустя 3 недели, укорененные регенеранты перемещали для адаптации к условиям ex vitro в закрытые пленкой контейнеры со стерильным песком (рис. 3, д, е).

Спустя 4 недели адаптированные растения пересаживали на почвенные субстраты соответственно их экологической приуроченности. Микророзетки менее 2 см в диаметре культивировали на среде ½ МС c добавлением 30 мг/л аденин сульфата, что способствовало их длительному поддержанию в культуре in vitro. При замедлении роста регенерантов (примерно год спустя) их листья изолировали и помещали на среду МС, содержащую 50 мг/л аденин сульфата и 0,5 мг/л ТДЗ, что позволило получить от одного экспланта до 10–25 микрорастений в зависимости от генотипа. Другими авторами также отмечено, что при микроразмножении бегоний внесение ТДЗ либо БАП в индукционную среду способствует образованию адвентивных побегов [5], а низкие концентрации регуляторов роста позволяют получить регенеранты путем прямого и непрямого органогенеза [6].

Отмечено, что у растений-регенерантов 4 таксонов бегоний при их пассаже со среды Кнудсена на среду МС c добавлением 50 мг/л аденин сульфата и 0,5 мг/л ТДЗ в результате ювенилизации нивелируются ритмологические особенности, присущие данным генотипам. Вследствие чего изменением ростовой активности бегоний в процессе их культивирования in vitro возможно управлять, чередуя питательные среды различного состава.

Выводы

На основе анализа ритмов роста и развития 4 таксонов рода Begonia разработаны различные способы их вегетативного размножения в условиях оранжерей и в культуре in vitro. Фенологические наблюдения явились основой для выявления оптимальных сроков размножения бегоний и проведения агротехнических приемов, а также усовершенствования методики микроклонального размножения, что позволяет существенно повысить коэффициент размножения бегоний. В условиях проведенного эксперимента органогенез адвентивных побегов из флоральных эксплантов бегоний происходил преимущественно прямым путем, а регенерационная способность зависела от генотипа и применяемых регуляторов роста. Для того чтобы длительно поддерживать бегонии в коллекции in vitro, необходимо пролиферирующие культуры переносить на среды с различным содержанием регуляторов роста и макроэлементов, уменьшая их содержание перед высадкой ex vitro. Полученные результаты могут быть использованы для сохранения и эффективного размножения ценных генотипов рода Begonia.

Работа выполнена в рамках государственного задания Центрального сибирского ботанического сада СО РАН при частичной поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект r_a № 17-44-540601). При подготовке публикации использовались материалы биоресурсной научной коллекции ЦСБС СОРАН «Коллекции живых растений в открытом и закрытом грунте», УНУ № USU 44053.