Процессы минерализации и стабилизации почвенного органического вещества (ОВ) играют важнейшую роль в гумусообразовании и его сохранении. Переход в раствор наиболее подвижной части поступающих в почву растительных остатков (РО) является первым и наиболее важным этапом трансформации ОВ почв. Растворенное органическое вещество (РОВ) представляет собой незначительную, но наиболее активную часть ОВ и в то же время наиболее доступную для минерализации. Часть РОВ полностью минерализуется в течение часов или суток [1]. Вместе с тем в ходе трансформации РО происходит селективная стабилизация растворенных ОВ минеральными матрицами почв за счет процессов избирательной адсорбции. Причем этот процесс происходит гораздо быстрее процессов биодеградации [2]. Для характеристики РОВ в природных водах и почвах широко используются методы оптической спектроскопии, вследствие их простоты и высокой чувствительности [3, 4]. Целью данной работы является исследование влияния минеральной среды на химический состав водорастворимого органического вещества (ВОВ), формирующегося в процессе гумификации РО в модельном эксперименте, методами ультрафиолетовой, видимой и флуоресцентной спектроскопии.
Материалы и методы исследования
В лабораторных условиях проведен эксперимент по инкубации органо-минеральных смесей разного состава при постоянных температуре (20 °С) и влажности (60 % от ПВ) в течение 6 месяцев. Органо-минеральные субстраты представляли собой смеси покровного суглинка, суглинка с бентонитовой (15 %) или каолинитовой глиной (30 %) с измельченным растительным материалом (в соотношении 1:10), инокулированные микроорганизмами. В эксперименте использовали надземную часть растений с различным биохимическим составом – кукурузы и клевера. Контролем служили варианты с РО, разлагающимися без минеральной среды. ВОВ извлекали из субстратов при соотношении твердая фаза: вода равном 1:2. Суспензии встряхивали на шейкере в течение 1 часа, после чего центрифугировали и фильтровали под вакуумом через мембранные фильтры с размерами пор 0,45 микрон (Merck Millipore). Фильтрат разделяли на кислотонерастворимую (КНФ) и кислоторастворимую (КРФ) фракции подкислением 0,1 М HCl до pH 1. Концентрацию углерода водных экстрактов (СВОВ) и углерод КРФ (СКРФ) определяли методом мокрого сжигания по Тюрину.
Спектральные исследования растворов проводили с помощью спектрофлуориметра Флюорат-02-Панорама фирмы Люмэкс. Измерения проводили при комнатной температуре 20 °±2 °, рН экстрактов доводили до значений 6,5–7,0. Спектры поглощения снимали в интервале длин волн 200–700 нм с шагом 5 нм. Регистрация спектров испускания флуоресценции проводилась в диапазоне 300–600 нм с шагом 5 нм при нескольких длинах волн возбуждения. Синхронные спектры флуоресценции снимали в интервале длин волн 250–550 нм при Δλ = 18 нм с шагом 5 нм [5].
По данным спектроскопии рассчитывали следующие характеристики:
1) удельный показатель поглощения SUVA254 при фиксированной длине волны по формуле
SUVA254 = A254/Сорг·l,
где А254 – оптическая плотность экстракта при 254 нм; Сорг – массовая концентрация растворенного органического углерода, мг/л; l – толщина поглощающего слоя, см [6];
2) индекс гумификации (HIX) по формуле
HIX = Σ I435>480 / Σ I300>345,
где I – интегральная интенсивность флуоресценции при соответствующих длинах волн в спектре испускания [7];
3) индекс флуоресценции (FI), определяемый как отношение интенсивностей флуоресценции I470 / I520 в спектре эмиссии при длине возбуждения λвозб = 370 нм [8].
Результаты исследования и их обсуждение
В зависимости от варианта эксперимента водные экстракты имели концентрацию 40–100 мгСорг/л. К концу инкубации доля водорастворимых соединений в суглинистых субстратах составила 1–3 % от общего содержания углерода (табл. 1). В групповом составе ВОВ суглинистых субстратов без внесения глинистых минералов преобладает кислоторастворимая фракция (СКНФ/СКРФ < 1). В присутствии бентонита и каолинита происходит увеличение содержания фракции осаждаемой кислотой.
Таблица 1
Содержание водорастворимого органического вещества экстрактов, отношение углерода осаждаемой кислотой фракции к кислоторастворимой фракции, удельный показатель поглощения по данным абсорбционной спектрометрии
|
вариант |
СВОВ, % от Собщ |
СКНФ/СКРФ |
SUVA254 |
|
клевер |
|||
|
суглинок |
1 |
0,10 |
0,040 |
|
суглинок + каолинит |
2 |
0,52 |
0,037 |
|
суглинок + бентонит |
2 |
1,11 |
0,048 |
|
РО свежие |
20 |
0,06 |
0,003 |
|
РО без минеральной среды |
11 |
0,28 |
0,017 |
|
кукуруза |
|||
|
суглинок |
1 |
0,50 |
0,047 |
|
суглинок + каолинит |
3 |
1,4 |
0,041 |
|
суглинок + бентонит |
3 |
2,6 |
0,055 |
|
РО свежие |
11 |
0,06 |
0,001 |
|
РО без минеральной среды |
8 |
0,12 |
0,003 |
В целом величина SUVA254 характеризует содержание ароматических фрагментов в составе ВОВ. Чем выше значения этого показателя, тем больше ароматических компонентов [6]. Значения SUVA254 ВОВ органо-минеральных субстратов составляет 0,037–0,050 л·мгС-1орг·см-1, что характерно для растворенного ОВ естественных почв [9]. Более низкие значения SUVA254 для экстрактов из РО указывают на преобладание в составе их ВОВ низкомолекулярных алифатических соединений, не поглощающих при 254 нм. Наибольшие значения SUVA254 соответствуют вариантам с внесением бентонитовой глины (табл. 1). Установлена положительная корреляция между показателем СКНФ/СКРФ и удельным поглощением. Подобная взаимосвязь указывает на увеличение доли КНФ в составе ВОВ, сопровождающееся повышением его ароматичности.
ВОВ является гетерогенной смесью водорастворимых компонентов растительного материала, продуктов его трансформации, микробной жизнедеятельности и микробной мортмассы. Спектры флуоресценции ВОВ исследуемых субстратов представляют собой широкие полосы с максимумами интенсивности в интервале 430–460 нм в зависимости от варианта (рис. 1). Интенсивности полос в целом уменьшаются при увеличении λвозб.
Рис. 1. Спектры флуоресценции ВОВ при различных длинах волн возбуждения (λвозб) через 6 месяцев инкубации РО клевера (варианты 1–3) и кукурузы (варианты 4–6). Варианты эксперимента: 1, 4 – суглинок + РО; 2, 5 – суглинок + каолинит + РО; 3, 6 – суглинок + бентонит + РО
Форма спектров свидетельствует о наличии в ВОВ флуорофоров различной природы, что соответствует составу ВОВ. Положение максимума в спектрах испускания зависит от природы ОВ. Вещества с простой структурой флуоресцируют в синей области спектра, в то время как более конденсированные соединения – в длинноволновой его части. Максимумы интенсивности в спектрах экстрактов из свежих РО находятся в области 340–355 нм, где проявляется флуоресценция низкомолекулярных веществ фенольной природы и ароматических аминокислот (рис. 2). Максимум флуоресценции в интервале 400–500 нм, характерный для ВОВ субстратов, обусловлен гуминоподобными ароматическими флуорофорами [5].
Рис. 2. Спектры флуоресценции ВОВ свежих остатков (А) и остатков инкубируемых без твердой фазы (Б). Условные обозначения: 1 – РО клевера; 2 – РО кукурузы
В спектрах флуоресценции ВОВ наблюдается смещение максимумов в красную область в ряду: ВОВ свежих остатков > ВОВ гумифицированных остатков без твердой фазы > ВОВ органо-минеральных субстратов. В зависимости от состава субстрата сдвиг максимума в длинноволновую область усиливается в следующем порядке: суглинок > суглинок + каолинитовая глина > суглинок + бентонитовая глина. Причем данная закономерность выявляется при инкубации обоих видов РО. Таким образом, присутствие каолинита и бентонита усиливает образование конденсированных структур в составе ВОВ. Следует отметить, что при увеличении длины волны возбуждения от 270 до 355 нм происходит смещение максимумов флуоресценции в область коротких длин. Подобное поведение спектров эмиссии является признаком высокой гетерогенности ВОВ.
На рис. 3 представлены спектральные показатели ВОВ по данным флуоресцентной спектрометрии. Индекс гумификации (HIX) является индикатором ароматического характера растворенного органического вещества, его зрелости и гидрофобности. Гумифицированный материал является более конденсированным, чем его предшественники, и сопровождается снижением отношения H/C. Увеличение данного индекса связано с увеличением длины волны эмиссии из-за усиления поликонденсации (более низкое отношение H/C) [7]. ВОВ негумифицированного растительного материала характеризуется величиной HIX 0,4–0,7. Значение индекса гумификации экстрактов, выделенных из органо-минеральных субстратов, составило 2,2–3,1. Таким образом, в присутствии минеральной среды степень гумификации РО существенно увеличивается.
Рис. 3. Индекс гумификации и индекс флуоресценции исследуемых экстрактов. Варианты эксперимента: 1 – суглинок + РО; 2 – суглинок + каолинит + РО; 3 – суглинок + бентонит + РО; 4 – свежие РО; 5 – РО, инкубируемые без минеральной среды
Индекс флуоресценции (FI) используется не только для оценки ароматичности ВОВ, но и в качестве индикатора его происхождения [8]. Высокие значения индекса флуоресценции (FI~1,7–2,0) свидетельствуют о преобладании продуктов микробного происхождения, а более низкие (FI~1,2–1,4) – о преобладании растительных компонентов в составе ОВ [7, 8]. Величина индекса флуоресценции ВОВ из субстратов варьировала в образцах от 1,7 до 2,3. Такие значения индекса характерны для ВОВ, в составе которых много белковых производных микробного происхождения [8]. Наибольшие значения FI отмечены для суглинистых субстратов без внесения глинистых минералов, свидетельствуя об их более низкой ароматичности. Наименьшие величины FI характерны для РО, инкубируемых в контакте с минеральными компонентами бентонитовой глины (рис. 3).
Синхронные спектры флуоресценции (ССФ) исследуемых ВОВ изображены на рис. 4. Видно, что при трансформации РО набор характеристических пиков в ССФ во многом определяется присутствующими минеральными компонентами. Так, для субстратов с бентонитом ССФ обладают интенсивной флуоресценцией в области 250–310 нм. Очевидно, это результат перекрывания трех полос с максимумами около 270, 285 и 300 нм. В данной области флуоресцируют в основном соединения белковой природы [5]. Как в случае с клевером, так и с кукурузой для синхронных спектров ВОВ в вариантах с каолинитом характерен более узкий пик с максимумом около 290–300 нм. Общий характер ССФ свидетельствует о том, что исследуемые ВОВ имеют близкий набор флуорофоров, но в разных соотношениях. Добавление бентонита и каолинита к суглинку существенным образом изменяет характер ВОВ, что связано, по-видимому, с процессами, происходящими на поверхности твердой фазы.
Рис. 4. Синхронные спектры флуоресценции ВОВ, экстрагируемого из суглинка (А), суглинка с внесением каолинита (Б) или бентонита (В) при трансформации РО клевера (1) и кукурузы (2)
Заключение
В ходе эксперимента установлено, что из исследуемых суглинистых субстратов извлекается до 3 % водорастворимых органических соединений от общего содержания углерода, что соответствует количеству ВОВ большинства нейтральных почв. Гипсохромный сдвиг максимумов интенсивности в спектрах эмиссии при увеличении длины возбуждения и характер синхронных спектров флуоресценции указывают на сложную гетерогенную систему ВОВ исследуемых субстратов. В составе ВОВ значительное место занимают соединения микробного происхождения. В процессе трансформации растительного материала происходит обогащение ВОВ ароматическими компонентами по сравнению с исходным растительным материалом. Наибольшая ароматичность характерна для связанного ОВ в составе органо-минеральных комплексов. В соответствии с «красным» сдвигом ароматичность и гидрофобность ВОВ возрастает в ряду: суглинок > суглинок + каолинитовая глина > суглинок + бентонитовая глина. Установлено, что независимо от вида разлагающихся остатков минеральная среда определяет тенденции, состав и размеры молекул ОВ переходящих в раствор.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ проекты № 16-34-01172 мол_а, № 16-04-00924.