В настоящее время применение целебных трав и аптечных сборов на их основе в традиционной и народной медицине особенно актуально, что обусловлено существенным преимуществом растений по сравнению с химическими медикаментозными препаратами. Главное из них – отсутствие побочных эффектов и комплексное воздействие на организм [1]. Лечебные эффекты многих лекарственных растений можно объяснить наличием природных антиоксидантов. Антиоксидант – это соединение с одним непрочно присоединённым электроном, который легко отдаётся свободному радикалу, стабилизируя и нейтрализуя его молекулу, переводя её в устойчивое состояние [2].
Основными источниками антиоксидантов для человека являются продукты питания на основе растительного сырья. Растения обладают достаточной устойчивостью к окислительным повреждениям, которые возникают при резком изменении физиологического состояния организма. Это обусловлено существованием в растительной клетке эффективных антиоксидантов, которые способны обеспечить защиту от кислородных радикалов [3].
В литературе предлагается большое число методов анализа количества и активности антиоксидантов в различных объектах. В данной работе применялся метод DPPH, который широко используется для определения антиоксидантной активности природных веществ. Преимуществами DPPH метода определения антиоксидантной активности являются простота регистрации реакции, высокая воспроизводимость, общедоступность необходимого оборудования, высокая чувствительность [4]. Имеются литературные данные, которые утверждают, что данный метод ограничивается возможностью определения только жирорастворимых антиоксидантов [5]. Да и сама методика рассчитана на применение стандартных растворителей (вода, этанол и метанол) [6].
Таким образом, целью работы являлось изучение особенностей измерения антирадикальной активности растительных экстрактов при использовании различных растворителей с применением стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила.
Материалы и методы исследования
В качестве объекта исследования использовали готовое сырье различных частей восьми видов лекарственных растений, приобретённых в аптечной сети: цветки бузины чёрной (Sambucus nigra L.), траву мелиссы лекарственной (Melissae officinali L.), цветки ромашки аптечной (Matricaria chamomilla L.), цветки бессмертника песчаного (Helichrysum arenarium L.), траву соссюреи горькой (Saussurea amara L.), траву горца птичьего (Polygonum aviculare L.), цветки липы сердцевидной (Tilia cordata L.) и побеги черники обыкновенной (Vaccinium myrtillus L.).
Для определения антирадикальной активности (АОА) растительных экстрактов применялся метод DPPH [6]. Анализ основан на спектрофотометрическом определении изменения концентрации стабильного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила. В качестве растворителей использовали: диметилсульфоксид (х.ч.), этанол 98 % (ГОСТ Р 51999-2002), ацетон (ос.ч.), диэтиловый эфир (х.ч.). Растворители обладают различной полярностью, что позволит экстрагировать из растительного сырья различные по структуре соединения. По полярности растворители можно распределить следующим образом: диэтиловый эфир < ацетон < этанол < диметилсульфоксид.
Для исследования антирадикальной активности лекарственных растений растительное сырьё массой 0,1 г растирали с 10 мл растворителя в фарфоровой ступке и количественно переносили в пробирку. Далее гомогенат центрифугировали в течение 15 мин при 6 тыс. об/мин при комнатной температуре. Из исходного экстракта готовили серию последовательных разбавлений: 0,25 мл каждого из полученных растворов серии приливали к 2,85 мл раствора DPPH и через 30 минут регистрировали значения оптической плотности при длине волны 515 нм на спектрофотометре (Shimadzu UV-3600, Япония). Каждый образец анализировали в трёх повторностях. В контрольном опыте вместо экстракта в реакционную систему вводили только растворитель. Исходя из полученных данных строили графики зависимости оптической плотности от количества исходного экстракта. Используя полученное уравнение кривой, вычисляли концентрацию экстракта, необходимую для реагирования 50 % от исходной концентрации DPPH (ЕС50). В качестве стандарта использовали растворы аскорбиновой кислоты и тролокса (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновой кислоты) известной концентрации. Тролокс является водорастворимым аналогом витамина Е и считается более предпочтительным стандартом при определении антирадикальных и антиоксидантных свойств экстрактов липофильных компонентов. Стандарт аскорбиновой кислоты используют для определения водорастворимых антиоксидантов. Данные по антирадикальной активности экстрактов лекарственных растений выражали в мг эквивалента аскорбиновой кислоты (АК) на грамм сухой массы (мг•экв. АК/г) и в мг эквивалента тролокса на грамм сухой массы (мг экв. тролокса/г).
Результаты исследования и их обсуждение
Для более точного определения концентрации в экстрактах растений веществ, активных в отношении радикала DPPH, необходимо было установить характер зависимости глубины превращения радикала за первые 30 минут реакции от начальной концентрации антиоксидантов в реакционной системе. На графиках представлены кинетические кривые на примере экстрактов липы сердцевидной (рис. 1) и мелиссы лекарственной (рис. 2) в зависимости от растворителей.
Рис. 1. Кинетические кривые оптической плотности раствора стабильного радикала DPPH при взаимодействии с АО экстрактов липы сердцевидной в среде разных растворителей
Рис. 2. Кинетические кривые оптической плотности раствора стабильного радикала DPPH при взаимодействии с АО экстрактов мелиссы лекарственной в среде разных растворителей
Как видно из представленных на рис. 1 данных, при использовании в качестве растворителей диметилсульфоксида (ДМСО) и ацетона в течение первых 10 минут наблюдалось резкое падение оптической плотности, затем реакция замедлялась, но не останавливалась полностью. При использовании этанола резкое падение наблюдалось в первые 15 минут реакции, затем реакция практически прекращалась. С диэтиловым эфиром лишь в самом начале процесса наблюдалось падение оптической плотности реакционной системы на незначительную величину, а затем реакция останавливалась.
Результаты исследования кинетических зависимостей протекания реакции взаимодействия DPPH-радикала с экстрактом мелиссы лекарственной представлены на рис. 2. При использовании в качестве растворителя ДМСО наблюдалось резкое падение оптической плотности в течение первых 10 минут, затем реакция протекала очень медленно. С ацетоном и диэтиловым эфиром падение оптической плотности наблюдалось также первые 10 минут, затем реакция останавливалась. С этанолом реакция протекала очень медленно без существенных колебаний.
Антирадикальные свойства характеризуются количественным соотношением высоко- и низкоактивных компонентов [4]. Это соотношение отражает форма кинетической кривой. За начальные участки кривых отвечают более активные компоненты экстрактов.
Исходя из вышеизложенного можно заключить, что ДМСО, как более полярный по сравнению с другими растворителями, извлекает больше веществ, обладающих антирадикальной способностью. Это подтвердилось и в ходе сравнительного анализа антирадикальных свойств экстрактов различных лекарственных растений. Результаты данного исследования представлены в табл. 1–2 в виде средних значений с указанием стандартного отклонения.
Как видно из табл. 1–2, антирадикальная активность экстрактов лекарственных растений зависела от используемого растворителя. Так, при использовании в качестве растворителей ДМСО и этанола наибольшую антирадикальную активность проявляли экстракты липы сердцевидной, наименьшую – соссюреи горькой. Например, при использовании в качестве экстрагента ДМСО антирадикальная активность для липы составила 110,7 ± 1,30 мг•экв. АК/г и 153,4 ± 1,45 мг экв. тролокса/г, тогда как для соссюреи горькой эти показатели были практически в 4 раза ниже – 28,3 ± 4,12 мг•экв. АК/г и 36,7 ± 3,95 мг•экв. тролокса/г.
Таблица 1
Значение антирадикальной активности растительного сырья в зависимости от растворителя (стандарт – аскорбиновая кислота)
|
Анализируемый объект |
АОА в зависимости от растворителя, мг•экв. АК/г |
|||
|
ДМСО |
Спирт 98 % |
Ацетон |
Диэтиловый эфир |
|
|
Липа сердцевидная |
110,7 ± 1,30 |
72,9 ± 2,41 |
76,5 ± 1,91 |
1,3 ± 0,24 |
|
Ромашка аптечная |
32,7 ± 0,74 |
6,2 ± 0,31 |
5,6 ± 0,56 |
0,6 ± 0,11 |
|
Соссюрея горькая |
28,3 ± 4,12 |
4,6 ± 0,86 |
10,5 ± 1,15 |
2,0 ± 0,48 |
|
Черника обыкновенная |
79,1 ± 0,46 |
19,9 ± 0,53 |
13,3 ± 0,38 |
1,0 ± 0,12 |
|
Мелисса лекарственная |
75,0 ± 1,72 |
5,9 ± 1,21 |
13,6 ± 1,62 |
3,5 ± 0,51 |
|
Бессмертник песчаный |
50,4 ± 2,10 |
13,3 ± 1,42 |
13,6 ± 1,24 |
5,0 ± 0,74 |
|
Горец птичий |
77,2 ± 1,85 |
12,2 ± 1,11 |
18,4 ± 0,78 |
1,1 ± 0,22 |
|
Бузина чёрная |
49,5 ± 3,32 |
8,9 ± 0,61 |
6,0 ± 0,47 |
0,7 ± 0,17 |
Таблица 2
Значение антирадикальной активности растительного сырья в зависимости от растворителя (стандарт – тролокс)
|
Анализируемый объект |
АОА в зависимости от растворителя, мг•экв. тролокса/г |
|||
|
ДМСО |
Спирт 98 % |
Ацетон |
Диэтиловый эфир |
|
|
Липа сердцевидная |
153,4 ± 1,45 |
115,0 ± 2,72 |
78,4 ± 2,00 |
1,4 ± 0,22 |
|
Ромашка аптечная |
45,2 ± 0,82 |
9,9 ± 0,28 |
5,7 ± 0,66 |
0,8 ± 0,17 |
|
Соссюрея горькая |
36,7 ± 3,95 |
7,6 ± 0,81 |
10,8 ± 1,17 |
2,2 ± 0,44 |
|
Черника обыкновенная |
114,0 ± 0,67 |
24,6 ± 0,61 |
13,6 ± 0,36 |
1,1 ± 0,10 |
|
Мелисса лекарственная |
107,2 ± 1,81 |
8,6 ± 1,37 |
13,9 ± 1,44 |
3,8 ± 0,49 |
|
Бессмертник песчаный |
70,0 ± 2,34 |
18,4 ± 1,51 |
14,0 ± 1,31 |
5,4 ± 0,70 |
|
Горец птичий |
106,6 ± 2,05 |
17,3 ± 1,13 |
18,9 ± 0,86 |
1,3 ± 0,23 |
|
Бузина чёрная |
64,4 ± 3,49 |
12,4 ± 0,54 |
6,2 ± 0,46 |
0,9 ± 0,15 |
В целом анализ полученных результатов позволяет расположить изученные растения в зависимости от АОА их экстрактов при использовании различных растворителей следующим образом (в порядке возрастания):
При использовании ДМСО: трава соссюреи < цветки ромашки < цветки бузины < цветки бессмертника < трава мелиссы < трава горца < побеги черники < цветки липы.
При использовании этанола: трава соссюреи < трава мелиссы < цветки ромашки < цветки бузины < трава горца < цветки бессмертника < побеги черники < цветки липы.
При использовании ацетона: цветки ромашки < цветки бузины < трава соссюреи < побеги черники < трава мелиссы < цветки бессмертника < трава горца < цветки липы.
При использовании диэтилового эфира: цветки ромашки < цветки бузины < побеги черники < трава горца < цветки липы < трава соссюреи < трава мелиссы < цветки бессмертника.
Кроме того, следует отметить, что при экстракции диэтиловым эфиром наблюдались очень низкие показатели антирадикальной активности для экстрактов всех исследуемых видов растений. Необходимо подчеркнуть, что при экстракции растительного сырья диэтиловым эфиром происходило заметное окрашивание экстрактов в зависимости от вида растения, так, например, экстракт бессмертника песчаного имел ярко-жёлтый цвет, а мелиссы лекарственной – зелёный. При этом при экстракции другими растворителями – окраска была более тусклой или цвет практически не менялся. Это свидетельствует о том, что диэтиловый эфир как растворитель извлекает вещества, которые практически не проявляют антирадикальной активности. Несмотря на то, что содержания экстрагированных веществ в экстрактах ацетона и этанола различны, их антирадикальные активности соизмеримы. Это обусловлено близкими показателями диэлектрической константы этих растворителей. Показатели антирадикальной активности между ними близки по сравнению с показателями при использовании ДМСО и диэтилового эфира.
Выводы
1. Кинетика протекания реакции радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила с растительными экстрактами зависела как от используемого растворителя, прежде всего от его полярности, так и от вида растения, то есть от качественного и количественного состава его антирадикальных компонентов.
2. Наибольшей антирадикальной активностью из анализируемых лекарственных растений обладали экстракты цветков липы сердцевидной.
3. Диметилсульфоксид является оптимальным растворителем, способным наиболее полно извлечь из сырья природные антиоксиданты.