Статины относятся к наиболее эффективным гиполипидемическим средствам, считаются относительно безопасными препаратами и хорошо переносятся. Среди побочных эффектов этой группы лекарственных средств наибольшее клиническое значение имеет специфическая лекарственная миопатия.
В современной медицинской литературе накоплен обширный фактический материал, посвящённый изучению патогенеза статиновой миопатии, однако не существует исчерпывающего представления о сложном комплексе молекулярных механизмов, лежащих в основе структурно-функционального повреждения мышц при приёме статинов.
Независимо от природы повреждающего агента, патофизиологический ответ клетки включает в себя ряд общих неспецифических реакций, одной из которых являются изменения в клеточной мембране [1].
Многочисленными исследованиями показано, что мембрана эритроцитов – наиболее доступная и удобная модель для изучения патобиохимических изменений в клетке при том или ином воздействии [2; 3]. Это связано с тем, что мембране эритроцитов присущи общие принципы организации плазматических мембран. При этом «простота» внутренней организации клетки даёт возможность изучать любые изменения без «помех», создаваемых внутриклеточными образованиями, и экстраполировать полученные результаты с небольшой поправкой на видовую специфичность тканей [4].
В то же время особенность структуры мембран эритроцитов позволяет им проходить через капилляры за счёт белок-белковых и белок-липидных контактов. Дефекты мембранных белков приводят к морфологическим и функциональным нарушениям эритроцитов, что сопровождается изменением реологических свойств крови.
В связи с этим целью настоящего исследования явился анализ структурно-функциональных изменений мембран эритроцитов животных с гиперхолестеринемией, получавших в течение длительного времени симвастатин (зокор).
Материалы и методы исследования
Исследование проводилось на беспородных крысах-самцах в возрасте 12–14 месяцев. Содержание животных соответствовало требованиям Приказа Минздрава РФ № 708Н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» и санитарным правилам СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) от 29.08.2014».
Контрольную группу составили 35 животных, которые содержались на общем рационе вивария и в течение 3 месяцев получали через пищеводный зонд 0,5 мл дистиллированной воды один раз в сутки.
У остальных животных индуцировали эссенциальную гиперхолестеринемию путём содержания в течение 3 месяцев на рационе, обогащённом животными жирами (топлёное сливочное масло) и легко усваиваемыми углеводами (тростниковый сахар, манная крупа). По истечении 3 месяцев у животных определяли уровень общего холестерина (ХС) на анализаторе Bayer (Германия). После подтверждения гиперхолестеринемии животные были разделены на две группы:
– группа 1 (сравнения) – 35 животных с гиперхолестеринемией, в течение 2 месяцев получавших рацион без добавления лекарственных веществ и 0,5 мл дистиллированной воды один раз в сутки через пищеводный зонд;
– группа 2 (экспериментальная) – 35 животных с гиперхолестеринемией, получавших в течение 2 месяцев симвастатин (Zocor, 20 мг) по 0,0012 г / 100 г массы один раз в сутки в виде водной суспензии через пищеводный зонд, что способствовало формированию статиновой миопатии.
По окончании срока эксперимента животных забивали декапитацией. Все манипуляции выполнялись в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к Приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.) и «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных» (Страсбург, 1986).
Эритроциты получали из крови, стабилизированной гепарином (10 ед/мл), центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 10 минут. Для определения использовали суспензию эритроцитов в физиологическом растворе из расчёта 0,5 мг/мл.
Микровязкость липидной фазы и белок-липидных контактов определяли методом латеральной диффузии зонда пирена в суспензии мембран эритроцитов [5]. Для этого суспензию клеток инкубировали 1 мин. в спиртовом растворе пирена, конечная концентрация которого составляла 8 мкМ. Микровязкость липидного слоя оценивали при λвозб. = 334 нм и λфлуор. = 395 нм, микровязкость зон белок-липидных контактов при λвозб. = 395 нм и λфлуор. = 470 нм. Эффективность переноса энергии электронного возбуждения с триптофановых остатков на пирен оценивали по тушению флуоресценции суспензии мембран эритроцитов при длине волны возбуждения 282 нм и длине волны флуоресценции 330 нм в отсутствии и после инкубации с зондом пирена. Полярность зон белок-липидных контактов оценивали по соотношению интенсивности флуоресценции двух мономерных форм F = 372/393.
Степень окислительной модификации белков суспензии мембран эритроцитов оценивали по интенсивности флуоресценции аминокислотных остатков. Интенсивность общей флуоресценции белков измеряли при λвозб. = 292 нм и λфлуор. = 347 нм, интенсивность флуоресценции ароматических аминокислот при λвозб. = 320 нм и λфлуор. = 400 нм, интенсивность флуоресценции поперечно сшитых белков при λвозб. = 360 нм и λфлуор. = 420 нм.
Активность аденозинтрифосфатного ферментного комплекса (Mg2+ и Са2+ – зависимой Na+/К+ – АТФ-азы) определяли по методу, основанному на расщеплении под влиянием фермента органических фосфорсодержащих соединений (АТФ) с образованием неорганического фосфата, который регистрировали по реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты. Результаты выражали в мкмоль/г Hb.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы STATISTICA 10.0 и Microsoft Exсel. Статистически достоверными считали отличия, соответствующие оценке ошибки вероятности р ≤ 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
В эритроцитах животных с экспериментальной гиперхолестеринемией наблюдали значительное увеличение микровязкости липидного бислоя (F = 334/395) на 186,67 % (р < 0,001) и выявлена тенденция к повышению микровязкости зон белок-липидных контактов (F = 395/470) на 18,38 % (p > 0,05) относительно контрольной группы (табл. 1).
Таблица 1
Структурно-функциональные характеристики мембран эритроцитов животных исследуемых групп (М ± m, n = 35)
|
Показатель |
Контрольная группа |
Группа сравнения (гиперхолестеринемия) |
Экспериментальная группа (гиперхолестеринемия + симвастатин) |
|
Микровязкость липидного бислоя (F = 334/395) |
0,0180 ± 0,0004 |
0,0516 ± 0,0019 р1 < 0,001 |
0,0320 ± 0,0013 p < 0,001 p1 < 0,001 |
|
Коэффициент полярности зон белок-липидных контактов (F = 372/393) |
1,0478 ± 0,086 |
1,8514 ± 0,209 р1 < 0,001 |
0,9677 ± 0,088 p < 0,001 p1 > 0,05 |
|
Интенсивность флуоресценции поперечно-сшитых белков (F = 360/420) |
0,0796 ± 0,004 |
0,0960 ± 0,006 р1 < 0,01 |
0,0742 ± 0,009 р < 0,05 p1 > 0,05 |
|
Микровязкость зон белок-липидных контактов (F = 395/470) |
5,2238 ± 0,309 |
6,1839 ± 0,488 p > 0,05 p1 > 0,05 |
6,0069 ± 0,754 p > 0,05 p1 > 0,05 |
|
Интенсивность флуоресценции ароматических аминокислот (F = 320/400) |
0,0433 ± 0,003 |
0,0300 ± 0,002 p1 < 0,001 |
0,0471 ± 0,004 p < 0,001 p1 > 0,05 |
|
Общая интенсивность флуоресценции (F = 292/347) |
256,70 ± 12,442 |
295,87 ± 22,966 p1 > 0,05 |
277,38 ± 27,772 p > 0,05 p1 > 0,05 |
Примечание: р – достоверно относительно контрольной группы; р1 – достоверно относительно группы сравнения.
Микровязкость считается интегральным показателем, который зависит от насыщенности жирных кислот, входящих в состав мембранных липидов, содержания холестерина, фосфолипидного состава и содержания белков [6]. Можно полагать, что выявленные изменения связаны с увеличением доли холестерина в клеточных мембранах, обусловленным развитием гиперхолестеринемии.
Обращает на себя внимание увеличение коэффициента полярности зон белок-липидных контактов (F = 372/393) на 76,69 % (р < 0,001) относительно контрольной группы (табл. 1), что свидетельствует о повышении гидрофильности липидного бислоя и аннулярных (пограничных) липидов [6].
Параллельно были выявлены: тенденция к увеличению общей интенсивности флуоресценции (F = 292/347) на 15,26 % (p > 0,05), достоверное увеличение интенсивности флуоресценции поперечно-сшитых белков (F = 360/420) на 20,60 % (р < 0,01) и снижение интенсивности флуоресценции ароматических аминокислот на 30,72 % (р < 0,01) по сравнению с контрольной группой (табл. 1). Полученные данные указывают, что в условиях гиперхолестеринемии в мембранах эритроцитов формируются структурные изменения, характеризующиеся увеличением межмолекулярных сшивок между компонентами мембран, что приводит к повышению степени погружения интегральных белков в липидный бислой и изменению их функциональной активности.
При определении активности мембранных АТФ-аз (табл. 2) была выявлена тенденция к снижению общей АТФ-азной активности на 13,75 % (p > 0,05) на фоне тенденции к повышению АТФ-азной активности в присутствии ионов Mg2+ на 23,92 % (p > 0,05) и выраженного роста активности АТФ-аз в присутствии ионов Са2+ на 110,41 % (р < 0,001) по сравнению с контрольной группой. Учитывая важнейшую регуляторную роль ионов Са2+ и Mg2+, можно полагать, что в условиях гиперхолестеринемии структурно-функциональные изменения в мембране эритроцита запускают «аварийную перестройку» регуляторных белков, направленную на поддержание внутриклеточного гомеостаза, что подтверждается данными определения структурно-функциональных показателей мембран эритроцитов.
Таблица 2
Активность мембранных АТФ-аз в эритроцитах животных исследуемых групп (М ± m, n = 35)
|
Показатель |
Контрольная группа |
Группа сравнения (гиперхолестеринемия) |
Экспериментальная группа (симвастатин + гиперхолестеринемия) |
|
АТФ-аза общ. (мкмоль/г Hb) |
176,462 ± 25,537 |
152,191 ± 8,775 p > 0,05 |
43,163 ± 5,268 p1 < 0,001 |
|
Са2+ АТФ-аза (мкмоль/г Hb) |
67,271 ± 5,947 |
141,546 ± 12,316 p < 0,001 |
55,593 ± 5,187 p1 < 0,001 |
|
Mg2+ АТФ-аза (мкмоль/г Hb) |
65,490 ± 7,329 |
81,158 ± 6,402 p > 0,05 |
98,071 ± 4,722 p1 < 0,001 |
Примечание: р – достоверно относительно контрольной группы; р1 – достоверно относительно группы сравнения.
После длительного введения симвастатина (экспериментальная группа) в эритроцитах животных установлено снижение микровязкости липидного бислоя на 38 % (р < 0,05) и тенденция к снижению микровязкости зон белок-липидных контактов относительно группы сравнения. Относительно контрольной группы микровязкость липидного бислоя оставалась повышенной на 77,38 % (р < 0,001), микровязкость зон белок-липидных контактов достоверно не отличалась (табл. 1).
В эритроцитах животных экспериментальной группы также выявлено снижение коэффициента полярности зон белок-липидных контактов на 47,43 % (р < 0,001) и интенсивности флуоресценции поперечно-сшитых белков на 22,71 % (р < 0,01), повышение интенсивности флуоресценции ароматических аминокислот на 57 % (р < 0,001), общая интенсивность флуоресценции достоверно не изменилась относительно группы сравнения (табл. 1). Важно отметить, что после введения животным симвастатина все показатели достоверно не отличались от значений контрольной группы.
Активность АТФ-аз в эритроцитах животных экспериментальной группы претерпела существенные изменения: так, выявлено снижение общей АТФ-азной активности на 71,64 % (р < 0,001), снижение АТФ-азной активности в присутствии ионов Са2+ на 60,72 % (р < 0,001), активность АТФ-аз в присутствии ионов Mg2+ повысилась на 20,84 % (р < 0,05) относительно группы сравнения (табл. 2). Относительно показателей контрольной группы общая АТФ-азная активность была снижена на 75,54 % (р < 0,001), АТФ-азная активность в присутствии ионов Са2+ на 17,36 % (р < 0,05), активность АТФ-аз в присутствии ионов Mg2+ повышена на 49,75 % (р < 0,001) (табл. 2).
Заключение
Анализируя представленный фактический материал, можно полагать, что длительное введение симвастатина экспериментальным животным способствует нивелированию структурно-функциональных сдвигов в мембранах эритроцитов, обусловленных гиперхолестеринемией, о чём свидетельствует достижение большинства показателей значений контрольной группы. В то же время сохраняющееся повышенное значение микровязкости липидного бислоя отражает снижение эластичности и деформируемости клеточной мембраны и, по-видимому, свидетельствует о снижении способности эритроцитов к прохождению через микроциркулярное русло, что имеет важнейшее значение для оценки реологических свойств крови.
Установленные изменения структурно-функционального состояния эритроцитов, очевидно, лежат в основе нарушения участия красных клеток в процессах коагуляции и, судя по характеру сдвигов белок-липидных контактов, могут способствовать формированию гиперкоагуляции в общем кровотоке.
В более ранних исследованиях нами установлено, что длительное введение симвастатина животных сопровождается гипоксическими изменениями в эритроцитах и миоцитах, характеризующимися снижением сродства гемоглобина к кислороду, развитием лактоацидоза, нарушением взаимодействий в системе ферментативных антиоксидантов [7].
Разобщение механизмов антиоксидантной защиты способствует активации свободно-радикального окисления в мембранах, что приводит к их уплощению или деструкции липидного слоя, укорочению жирных кислот, что приводит к нарушению транспортной функции мембран.
Изменение общей АТФ-азной активности после введения симвастатина в целом указывает на снижение вовлечения АТФ в процессы дефосфорилирования и, следовательно, о недостаточной обеспеченности биологической сохранности эритроцитов. Обращает внимание разнонаправленность сдвигов специфических АТФ-аз: достоверное усиление использования АТФ в присутствии ионов Mg2+ и снижение активности Са2+-зависимой АТФ-азы позволяет полагать, что формируется тенденция к нормализации Са2+-зависимого гомеостаза и активируются процессы, направленные на стабилизацию функциональной полноценности эритроцитов. С другой стороны, сохранение повышенного уровня АТФ-азной активности в присутствии ионов Mg2+ может отражать снижение содержания внутриклеточного Mg2+. Недостаток Mg2+ способствует изменению жирнокислотного состава мембранных липидов, что нашло отражение в повышении микровязкости липидного бислоя как в группе сравнения, так и в экспериментальной группе.
Принимая во внимание, что препараты первого поколения статинов не теряют свою актуальность, можно полагать, что для снижения риска поражения мышц при их длительном приёме целесообразным является включение в схемы терапии препаратов, обладающих антигипоксантным, антиоксидантным и мебраностабилизирующим действием.