Сахалин является самым крупным островом России. Минеральные подземные воды широко распространены на всей территории острова Сахалин и представлены как глубинными водами, вскрытыми скважинами, так и естественными холодными и термальными минеральными источниками. Наиболее крупные месторождения и проявления расположены в пределах Северо-Сахалинского гидрогеологического бассейна напорных вод (Дагинское месторождение гидротерм, Лунские и Паромайские термальные источники). Химический состав подземных вод Сахалина изучен сравнительно слабо, наибольший вклад в его исследования в разные годы внесли В.В. Иванов, Н.Д. Цитенко, М.А. Штейн, И.Г. Завадский, Т.С. Розорителева и др. [1–3]. Известно, что минеральные источники являются естественной средой обитания различных микроорганизмов. Бактерии в воде и в биоматах, образующихся в местах выхода минеральных вод, играют важную роль в функционировании экосистем, осуществляя процессы продукции и деструкции органического вещества, участвуя в геохимических циклах элементов [4–5]. Однако распространение бактерий различных эколого-трофических групп в микробных матах минеральных источников о. Сахалин ранее не было изучено.
Цель исследования: исследовать физико-химический состав вод, а также изучить распространение, состав, структуру и численность различных физиологических групп бактерий в микробных матах минеральных источников острова Сахалин.
Материалы и методы исследования
Объектами исследования являлись холодные минеральные воды Антоновские и Невельские (температура 8,0–10,0 °С), расположенные в западной части о. Сахалин, и термальные минеральные воды Дагинского месторождения (источник Александровский, 45,2 °С), расположенные в северо-восточной части острова, недалеко от п. Горячие ключи. Во всех изученных минеральных водах на выходе отмечено формирование микробных матов. В Антоновских источниках отобрано два типа микробных матов (А1B, A14). Пробы минеральных вод и микробных матов отбирали, соблюдая условия стерильности, в стеклянные бутыли и пластиковые емкости объемом 200 мл в трех повторностях. Отбор проб осуществляли в июне 2015 г. Часть проб фиксировали на месте с добавлением 40 % формалина. Остальную часть хранили не более 12 ч в холодильнике, затем анализировали в лаборатории. Нестабильные показатели химического состава (рН, температура) измерялись непосредственно на месте. Водные пробы для анализа анионов и катионов фильтровали через мембранные фильтры (нитрат целлюлозы, 0,45 μm, Sartorius) на месте отбора для удаления взвеси и затем были подкислены азотной кислотой. Химический анализ проб выполнен на базе аналитического центра ДВГИ ДВО РАН.
Для выявления и культивирования бактерий использовали традиционные методы практической микробиологии [6]. Численность различных эколого-трофических групп бактерий определяли методом предельных разведений и методом Коха. Количество различных физиологических групп бактерий определяли на специально подобранных селективных средах [7]. Микроорганизмы выращивали в термостате при температуре 25 °С и 45 °С. Анаэробные формы бактерий культивировали в анаэростате с использованием газогенерирующих пакетов BD GasPak EZ. Морфологию, размеры, подвижность выделенных чистых культур исследовали с использованием светового микроскопа AxioStar plus (Carl Zeiss, Германия). Тип клеточной стенки бактерий определяли по Граму [8]. Идентификацию микроорганизмов до рода проводили согласно определителю Берджи [9].
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования химического состава минеральных вод показали, что Антоновские и Невельские источники характеризовались низкой температурой (8–10 °С), различным рН, преобладанием в составе катионов натрия, в составе анионов – гидрокарбонат-, хлор- и сульфат-ионов. В микроэлементном составе вод превалировали кремний, бор, йод и стронций (табл. 1). Воды Александровского источника отличались более высокой температурой (45,2 °С), нейтральным рН, высокой минерализацией (1,67 г/л). В составе катионов преобладал натрий, в составе анионов – хлор и гидрокарбонат-ионы. Воды были значительно обогащены кремнием, йодом, бором и железом (табл. 1). В газовом составе источников преобладал метан (69 %), азот (29 %) и сероводород (1,1 %).
Результаты микробиологических исследований показали, что в обследованных микробных матах отмечена довольно высокая численность функциональных групп бактерий, которая варьировала от 0 до 4,8×108 кл/см3. В микробных матах Антоновского и Невельского источников значительно преобладали бактерии цикла серы и углерода (табл. 2). Количество микроорганизмов цикла серы в матах холодных сероводородных источников достигало наибольших значений, при этом во всех пробах значительно преобладали бесцветные серобактерии (7,4×105 (А14) – 4,8×108 (Невельский) кл/см3). Бесцветные серобактерии в Антоновском и Невельском минеральных источниках формировали белые микробные маты в виде белых косм. Идентификация культур нитчатых серобактерий показала, что во всех пробах они были представлены микроорганизмами рода Thiotrix sp (рис. 1).
Таблица 1
Физико-химический состав минеральных вод о. Сахалин
|
Точки отбора |
t, °C |
pH |
Na |
Ca |
Mg |
K |
CI |
SO4 |
HCO3 |
F |
|
г/л |
||||||||||
|
1 |
10 |
9,1 |
0,067 |
0,005 |
0,0005 |
0,0003 |
0,032 |
0,016 |
0,11 |
0,0002 |
|
2 |
8 |
6,5 |
0,091 |
0,0115 |
0,0023 |
0,0009 |
0,065 |
0,034 |
0,116 |
0,0001 |
|
3 |
45,2 |
6,53 |
0,587 |
0,0198 |
0,0013 |
0,0045 |
0,709 |
0,001 |
0,405 |
0,0006 |
|
Точки отбора |
TDS г/л |
Eh mV |
Fe |
Mn |
Si |
Al |
Ba |
Sr |
I |
B |
|
мг/л |
||||||||||
|
1 |
0,25 |
–219 |
0,1 |
0,001 |
8,7 |
0,007 |
– |
0,001 |
0,5 |
0,47 |
|
2 |
0,33 |
–224 |
0,1 |
0,06 |
10 |
0,01 |
0,001 |
0,16 |
0,01 |
0,76 |
|
3 |
1,67 |
–42 |
0,25 |
0,001 |
19,7 |
0,015 |
0,04 |
0,6 |
4,1 |
0,27 |
Примечание. 1 – Невельский источник; 2 – Антоновский источник; 3 – Александровский источник.
Рис. 1. Морфология нитчатых бесцветных серобактерий рода Thiotrix sp., выделенных из белых матов минеральных источников Антоновский и Невельский
Наибольшая численность бесцветных серобактерий отмечена в минеральном источнике Невельский, который отличался более низкой минерализацией вод и более щелочными условиями (табл. 1, 2). Клетки бесцветных серобактерий на поверхности формировали белые минеральные отложения. Элементный анализ белых отложений показал, что они состоят из элементной серы, содержание которой достигает 99 %. Биологическая роль бесцветных серобактерий в микробных матах заключается в окислении сероводорода, который поступает с вулканическими флюидами, а также из донных осадков и микробных матов в результате микробной сульфатредукции, до элементной серы, которая накапливается в протоплазме клеток и затем окисляется до сульфатов. Образованные сульфаты восстанавливаются до сероводорода с участием анаэробных сульфатредуцирующих бактерий. Численность сульфатредуцирующих бактерий в пробах микробных матов холодных источников была достаточно высока и изменялась от 6,4×105 (А14) до 5,2×106 (Невельский) кл/см3, что подтверждает частично биогенное происхождение сероводорода. Присутствие сульфатов в составе холодных минеральных вод способствует активной деятельности сульфатредуцирующих бактерий (табл. 1). Подобное преобладание в структуре бактерий цикла серы было отмечено нами ранее в углекислых минеральных водах Приморья [10]. Кроме бесцветных серобактерий в окислении сероводорода участвуют хемолитоавтотрофные тионовые бактерии, которые окисляют его до элементной серы, которую откладывают снаружи клетки. Тионовые бактерии были отмечены только в матах Антоновского источника (1,8–4,7×104 кл/см3), где количество бесцветных серобактерий было ниже (табл. 2).
Таким образом, показан вклад бактерий цикла серы в образование и окисление сероводорода и сульфатов в холодных минеральных источниках о. Сахалина. В цикле углерода в микробных матах холодных минеральных источников Антоновский и Невельский принимали участие различные эколого-трофические группы бактерий (табл. 2). Численность бактерий варьировалась от 0 до 2,7×106 кл/см3, при этом значительно преобладали сапрофитные микроорганизмы, что указывает на происходящие процессы деструкции органического вещества в микробных матах. В пробе мата А14 Антоновского источника, отличающегося присутствием грунтов, отмечены анаэробные метанообразующие бактерии, численность которых была невысока и составляла 5,6×102 кл/см3. Метанообразующие бактерии осуществляют конечный этап анаэробного разрушения органических веществ, и их присутствие в минеральных водах свидетельствует о наличии органических веществ и анаэробной обстановке. Меньше всего в микробных матах холодных минеральных источников были представлены бактерии цикла железа и марганца, что связано с низким содержанием этих элементов в подземных водах (табл. 1, 2).
В микробных матах термальных вод Александровского термального источника (Дагинское местрождение) преобладали бактерии цикла углерода и азота (табл. 2). Количество микроорганизмов цикла углерода в матах терм варьировало от 1,0×103 до 3,7×106 кл/см3, при этом значительно преобладали анаэробные формы сапрофитных бактерий. На начальных этапах деструкции главную роль играют микроорганизмы-гидролитики, разлагающие полимерные соединения. Доминирующими были целлюлозоразлагающие бактерии, их численность достигала 7,2×104 кл/см3, что указывает на протекание процессов разложения целлюлозы в матах. Также в мате терм были отмечены достаточно высокие количества метанообразующих бактерий, которые составляли 8,4×104 кл/см3. Метаногены являются облигатно анаэробными микроорганизмами и получают энергию для роста от двуокиси углерода, водорода и ацетатов, которые образуются в результате деятельности комплекса сапрофитных, гидролитических, ферментативных, ацетогенных микроорганизмов [11, 12]. Присутствие метаногенов в пробах мата свидетельствует о происходящих в источниках процессах биогенного образования метана. Изотопные данные, полученные ранее в этих водах, подтверждают биогенный характер метана из термальной зоны Даги [2]. В цикле азота доминировали аммонифицирующие, денитрифицирующие бактерии и гетеротрофные нитрификаторы, что указывает на происходящие в матах процессы разложения азотсодержащих органических веществ (табл. 2). В цикле железа и марганца в микробных матах термального источника Александровский отмечена достаточно высокая численность анаэробных марганецвосстанавливающих и железоокисляющих бактерий, количество которых составляло 7,0×102 кл/см3, что совпадало с более высоким содержанием железа в этих водах (табл. 1). Наименее были развиты микроорганизмы геохимического цикла серы.
Из накопительных культур микробных матов минеральных источников о. Сахалин были выделены чистые штаммы термофильных, мезофильных и психрофильных бактерий. Среди выделенных гетеротрофных микроорганизмов преобладали колонии светло-серого, бежевого и молочного оттенка, лишенные пигмента (рис. 2, а–в).
Таблица 2
Численность различных физиологических групп бактерий в микробных матах минеральных источников о. Сахалин
|
Функциональные группы бактерий: (кл/см3) |
Антоновский источник |
Невельский |
Александровский |
|
|
А1B |
A14 |
|||
|
Цикл углерода: |
||||
|
Сапрофитные бактерии, аэробы |
1,6×104 |
3,2×105 |
1,5×105 |
1,7×105 |
|
Сапрофитные бактерии, анаэробы |
2,0×105 |
2,7×106 |
2,0×106 |
3,7×106 |
|
Протеолитические бактерии |
3,5×102 |
8,1×102 |
6,0×102 |
1,0×103 |
|
Целлюлозоразлагающие бактерии |
0 |
1,9×102 |
0 |
7,2×104 |
|
Метанообразующие бактерии |
0 |
5,6×102 |
0 |
8,4×104 |
|
Цикл азота: |
||||
|
Азотфиксирующие |
0,7×102 |
1,2×103 |
0 |
0 |
|
Аммонификаторы |
3,1×102 |
0 |
0 |
1,2×103 |
|
Автотрофные нитрификаторы |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Гетеротрофные нитрификаторы |
0 |
5,2×104 |
0 |
6,0×104 |
|
Денитрифицирующие |
0 |
0 |
0 |
3,2×104 |
|
Цикл серы: |
||||
|
Тионовые |
4,7×104 |
1,8×104 |
0 |
0 |
|
Сульфатредуцирующие |
6,4×105 |
1,2×106 |
5,2×106 |
1,6×102 |
|
Бесцветные серобактерии |
9,5×106 |
7,4×105 |
4,8×108 |
0 |
|
Цикл железа, марганца: |
||||
|
Железоокисляющие гетеротрофы |
0 |
0 |
0 |
7,0×102 |
|
Железовосстанавливающие |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Марганецокисляющие гетеротрофы |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
Марганецвосстанавливающие |
0 |
3,8×103 |
0 |
2,5×104 |
|
Цикл кремния: |
||||
|
Силикатные бактерии |
0 |
4,5×104 |
9,5×104 |
1,2×104 |
а) б) в)
Рис. 2. Типы колоний гетеротрофных бактерий, выделенных из микробных матов минеральных источников о. Сахалин
Микроскопирование колоний показало, что бактерии, выделенные из микробных матов минеральных источников Антоновский и Невельский, были в основном представлены грамположительными достаточно крупными спорообразующими палочками (1,57–1,95 мкм длина; 0,86–0,98 мкм ширина), а также грамотрицательными короткими палочками разной длины (0,25–0,61 мкм длина; 0,31–0,39 мкм ширина). Микроорганизмы, выделенные из матов термальных вод Александровский, были в основном представлены грамположительными, спорообразующими, преимущественно подвижными палочками размерами 1,65–2,41 мкм длина; 0,91–0,99 мкм ширина и крупными нитевидными споровыми палочками 3,67–7,66 мкм в длину. По типу питания большинство штаммов относятся к хемоорганотрофам. Каталазная и оксидазная активность была отмечена у большинства штаммов. В микробных матах в целом отмечено небольшое разнообразие культивируемых форм бактерий, при этом во всех исследуемых минеральных источниках доминировали бактерии рода Bacillus sp. Бактерии рода Bacillus sp. повсеместно распространены, выделяются из различных термальных источников и были изолированы нами ранее в техногенных водах и грунтах хвостохранилищ, а также в подземных высокоминерализованных водах Приморского края [13, 14].
Заключение
Проведенные исследования показали, что в минеральных водах о. Сахалин среди катионов преобладал натрий, среди анионов – гидрокарбонат и хлор-ионы, в микроэлементном составе источников превалировали кремний, йод, бор, железо и стронций. В микробных матах, формирующихся на выходах минеральных источников о. Сахалин, отмечена достаточно высокая численность различных функциональных групп бактерий, которые играют важную роль в геохимических циклах углерода, азота, серы, железа и марганца. В структуре микробных сообществ холодных вод доминировали микроорганизмы цикла серы и углерода, что указывает на происходящие процессы окисления органических веществ и восстановленных соединений серы с участием микроорганизмов. В матах термальных источников преобладали сапрофитные, метанобразующие бактерии и микроорганизмы цикла азота. Выделены чистые культуры бактерий, которые были представлены в основном грамположительными, спорообразующими подвижными палочками, из которых значительно преобладали бактерии рода Bacillus sp.