Кульдурское месторождение термальных вод располагается во внутриконтинентальной части юга Дальнего Востока, в районе поселка Кульдур Еврейской автономной области. Кульдурские источники выходят в центральной части Пионерского гранитного массива и приурочены к зоне меридионального разлома на участке пересечения с оперяющим его нарушением северо-восточного направления. Вмещающими породами являются палеозойские граниты и гранодиориты. Воды Кульдурского термального поля щелочные фторидно-хлоридно-кремниево-гидрокарбонатные натриевые, слабоминерализованные. Температура воды достигает 73 °С. Содержание общего углерода органического имеет невысокие значения и колеблется в пределах 0,3–3,7 мг/дм3 [1].
Известно, что термальные источники являются естественной средой обитания различных микроорганизмов. Водное микробное сообщество и бактериальные маты, образующиеся в местах выхода термальных вод, являются уникальным объектом исследований, поскольку они вовлечены в большое разнообразие трансформаций элементов, многие из этих трансформаций являются ключевыми стадиями геохимических процессов, происходящих в гидротермальных экосистемах. Гетеротрофные бактерии являются важным компонентом термальных вод и микробных матов, поскольку осуществляют деструкцию органических веществ и могут обладать уникальными свойствами и являться потенциальными продуцентами термостабильных ферментов [2, 3]. Изучение термофильных гетеротрофных бактерий, их потенциальной ферментативной активности и физиолого-биохимических особенностей представляет большой практический интерес, так как бактерии и продуцируемые ими ферменты могут найти широкое применение в промышленности, в том числе пищевой, фармацевтической, текстильной и других областях. Ранее было показано, что термальные воды Кульдур населены различной микрофлорой, но в небольшой численности [4]. Однако отсутствуют данные о потенциальной внеклеточной ферментативной активности бактерий, выделенных из Кульдурских терм, и их физиолого-биохимических свойствах.
Цель исследования: исследовать химический состав вод месторождения Кульдур, выделить гетеротрофные бактерии и изучить их некоторые физиолого-биохимические свойства и потенциальную внеклеточную ферментативную активность.
Материалы и методы исследования
Пробы воды отбирали в стеклянные бутыли объемом 1000 мл в трех повторностях, соблюдая условия стерильности, из скважин 1-87, 2-87, 3-87, 3-51, 5-51 термальных вод месторождения Кульдур. Отбор проб осуществляли в августе 2015 г. Также проводили отбор микробных матов, формирующихся на выходах термальных источников. Всего было отобрано 2 типа микробных мата. Отобранные пробы хранили в холодильнике не более 12 ч, затем анализировали в лаборатории. Химический анализ термальных вод осуществляли в аккредитованной лаборатории Дальневосточного геологического института ДВО РАН г. Владивосток. Для выделения и культивирования бактерий использовали традиционные методы практической микробиологии [5]. Для выделения термофильных микроорганизмов использовали питательные среды с различными донорами и акцепторами электронов [6]. Гетеротрофные бактерии учитывали на питательной среде YK следующего состава (г/л): CaCO3 – 1; MgSO4* 7H2O – 1; пептон – 5; дрожжевой экстракт – 5; глюкоза – 0,2; K2HPO4 – 0,2 [7]. Выделение микроорганизмов из подземных вод производили методом мембранной фильтрации. Микроорганизмы выращивали в термостате при температурах 25 °С и 50ºС в течение 1–7 суток. Тип клеточной стенки бактерий определяли по методу Грама. Морфологию, размеры, подвижность, спорообразование выделенных чистых культур исследовали с использованием светового микроскопа AxioStar plus (Carl Zeiss, Германия) [8]. Способность штаммов к росту при различных температурах и значениях рН питательной среды исследовали при инкубировании в среде YK. Диапазон рН устанавливали с разными концентрациями бикарбоната и карбоната натрия (от 5,0 до 13,0). Для изучения способности бактерий утилизировать моно- и дисахариды, спирты использовали готовые среды Гисса «Биокомпас-С» (Углич, Россия). Тестирование выделенных изолятов на наличие внеклеточных ферментов каталазы, протеазы, амилазы, липазы, лецитиназы проводили согласно [8]. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате при температурах 25 °С и 50 °С в течение 2–3 суток. О наличии энзиматической активности судили по появлению зон гидролиза субстрата вокруг посева бактерий на соответствующих средах.
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты исследования химического состава термальных вод показали, что среди катионов в изученных скважинах значительно преобладали натрий (89,0–94,3 мг/л) и кремний (43,3–52,3 мг/л), при этом почти отсутствовал магний (0,0–0,03 мг/л). Среди анионов доминировали хлор (31,5–34,9 мг/л), фтор (17,7–18,9 мг/л) и сульфат-ионы (15,9–18,5 мг/л). В микроэлементном составе изученных вод наиболее преобладали литий (351,8–369,7 мкг/л), мышьяк (79,2–113,1 мкг/л) и стронций (65,3–83,3 мкг/л) (табл. 1). Отличительной чертой термальных вод этих скважин является высокая температура (до 72 °С), низкая минерализация 0,30–0,36 г/л и щелочная реакция (рН = 9,4–9,7). Как растворенные, так и спонтанные газы исследуемых терм представлены в основном азотом (до 98 об. %), примеси других газов (CO2, H2S, O2), как правило, незначительны.
Таблица 1
Химический состав термальных вод месторождения Кульдур
|
Скважины: |
Катионы/Анионы, мг/л |
Микроэлементы, мкг/л |
|||||||
|
Na |
Si |
F |
Cl |
SO4 |
Li |
As |
Sr |
Al |
|
|
1-87 |
89,1 |
51,9 |
17,9 |
31,5 |
15,9 |
369,7 |
110,2 |
68,8 |
57,7 |
|
2-87 |
87,7 |
51,9 |
18,0 |
32,0 |
16,1 |
351,8 |
113,1 |
68,6 |
40,35 |
|
3-87 |
94,3 |
43,3 |
18,9 |
34,9 |
18,5 |
353,8 |
79,2 |
83,3 |
5,93 |
|
3-51 |
89,5 |
52,3 |
17,9 |
31,7 |
17,8 |
355,0 |
109,8 |
68,5 |
53,9 |
|
5-51 |
89,0 |
51,2 |
17,7 |
31,8 |
18,5 |
368,6 |
108,6 |
65,3 |
24,22 |
Из термальных вод и бактериальных матов месторождения Кульдур на различных селективных средах были выделены чистые культуры мезофильных и термофильных гетеротрофных бактерий. Всего было изолировано 35 чистых культур (12 штаммов из подземных вод, 23 штамма из микробных матов). Среди изолированных из подземных вод гетеротрофных микроорганизмов преобладали плоские, матовые и глянцевые, светло-бежевые колонии с неровным краем, а также пигментированные светло-желтые и оранжевые выпуклые блестящие колонии (рисунок, а–в). Морфологическое разнообразие выделенных из бактериальных матов колоний было выше, здесь отмечены в основном колонии лишенные пигмента: различных оттенков бежевые, плоские и выпуклые, а также прозрачные, выпуклые и молочного цвета колонии (рисунок, г–е). По количеству выделенных бактерий значительно преобладали в подземных водах всех изученных скважин и микробных матах крупные грамположительные неподвижные спорообразующие каталазоположительные палочки размером 2,21–5,45 мкм в длину. Подобные крупные грамположительные палочки были выявлены нами ранее в подземных рассолах и техногенных водах хвостохранилищ Приморского края [9, 10]. Остальные изоляты были представлены палочками различной длины, а также кокками, спирохетами и вибрионами.
а) б) в)
г) д) е)
Внешний вид колоний гетеротрофных бактерий, выделенных из термальных вод (а–в) и микробных матов (г–е) месторождения Кульдур
Исследование некоторых морфо-биохимических особенностей чистых культур гетеротрофных бактерий показало, что штаммы в основном были грамотрицательными (60 %), преимущественно неподвижными (70 %), аспорогенными (70 %), каталазоположительными (80 %) и оксидазоотрицательными (90 %) палочками с различным отношением к кислороду (табл. 2). Выделенные гетеротрофные бактерии больше всего были способны ферментировать глюкозу (65 %), т.е. обладали ферментативным типом метаболизма. По типу питания большинство штаммов относились к хемоорганотрофам. Исследование физиологических характеристик штаммов показало, что в целом культуры обладали способностью к росту в широком диапазоне рН 5,0–13,0 и температуры (до 60 °С) (табл. 3). Выявленные особенности роста данных микроорганизмов могут свидетельствовать об их приспособленности к высоким температурам и щелочным условиям среды. Культуры бактерий использовали широкий спектр субстратов. Все штаммы обладали способностью к росту на среде с комплексными субстратами, внесенными в качестве единственных источников углерода и энергии – дрожжевом экстракте и пептоне.
Таблица 2
Морфо-биохимические характеристики некоторых выделенных из термальных вод и микробных матов Кульдур культивируемых гетеротрофных бактерий
|
Место выделения |
Штамм, № |
Внешний вид колоний |
Морфология клеток |
Окраска по Граму |
Подвижность |
Наличие спор |
Каталаза/оксидаза |
|
Подземные воды |
4 |
Светло-бежевые плоские, матовые с неровным краем |
Крупные палочки |
+ |
– |
+ |
+/– |
|
15 |
Светло-желтые мелкие колонии |
Диплококки |
+ |
– |
– |
+/– |
|
|
21 |
Оранжевые блестящие с ровным краем |
Мелкие спирохеты |
– |
+ |
– |
+/– |
|
|
24 |
Светло-бежевые блестящие с ровным краем |
Длинные палочки |
– |
+ |
– |
–/– |
|
|
Микробный мат |
1 |
Молочные, блестящие |
Мелкие кокки |
– |
– |
– |
+/– |
|
8 |
Молочно-бежевые, блестящие |
Мелкие палочки |
– |
+ |
– |
–/– |
|
|
11 |
Светло-бежевые плоские, матовые с неровным краем |
Крупные палочки |
+ |
– |
+ |
+/– |
|
|
27 |
Пленочный рост |
Прямые длинные палочки |
+ |
+ |
– |
+/+ |
|
|
30 |
Светло-бежевые, выпуклые, гладкие |
Толстые длинные палочки |
– |
– |
+ |
+/– |
|
|
34 |
Прозрачные, блестящие |
Вибрионы |
– |
– |
– |
+/– |
Исследуемые штаммы были способны утилизировать достаточно широкий спектр сахаров и спиртов: глюкозу, фруктозу, мальтозу, лактозу, галактозу, маннозу, раффинозу, а также маннит и сорбит. Слабый рост для большинства культур отмечен на рамнозе, сахарозе и ксилозе. Чрезвычайно важную роль на начальных этапах расщепления органических субстратов играют микроорганизмы, выделяющие в среду гидролитические ферменты. В связи с этим исследовали потенциальную внеклеточную ферментативную активность выделенных культур бактерий (протеолитическую, лецитиназную, липолитическую и амилолитическую). Тестирование проводили при двух температурных режимах (25 °С и 50 °С). Результаты исследования показали, что амилолитической активностью обладали наибольшее количество штаммов бактерий (80–90 %), при этом оптимальной для большинства культур была температура инкубации 50 °С, где они проявляли наибольшую активность. Ширина зоны просветления амилолитической активности варьировала от 2 до 19 мм, достигая максимальных значений при более высокой температуре. Наибольшую амилазную активность проявляли как грамположительные (№ 11), так и грамотрицательные штаммы бактерий (№ 21, № 34, № 30). Протеолитической активностью обладали 40–60 % от изученных штаммов, при этом она была выше при температуре инкубации 50 °С. Наиболее активно протеазы вырабатывали микробные культуры № 11, № 15 (грамположительные) и № 24 (грамотрицательные), при этом ширина зоны просветления составляла 5–16 мм. Липазную активность проявляли 20–40 % от общего количества протестированных штаммов, при этом наибольшая активность отмечена при температуре 50 °С. Ширина зоны просветления достигала 0–10 мм, наибольшие значения отмечены у грамотрицательных (№ 8, № 30) и грамположительных (№ 4) культур. Наименьшую активность бактерии проявили по расщеплению лецитина (лецитиназа), суммарно только 0–10 % из 35 протестированных штаммов. При этом наибольшая активность отмечена при температуре 50 °С. Штаммы гетеротрофных бактерий, выделенные из подземных вод в целом, обладали меньшей гидролитической активностью. Штаммы грамположительных бактерий № 11 и грамотрицательных микроорганизмов № 30 отличались проявлением множественной протеазной, амилазной и липазной ферментативными активностями. Штамм грамотрицательных бактерий № 1, выделенный из микробного мата, характеризовался проявлением всех видов ферментативной активности, особенно при температуре 50 °С, и был способен утилизировать многие сахара, спирты и обладал, по сравнению с другими гетеротрофными бактериями, достаточно широким диапазоном роста (рН до 13, температура до 60 °С) (табл. 3). Выделенные культуры микроорганизмов являются перспективными для использования в области биотехнологии.
Таблица 3
Рост выделенных из воды и микробных матов Кульдур штаммов гетеротрофных бактерий при различных температурах и рН
|
Штамм, № |
Рост бактерий |
|||||||||||||
|
Температура, °С |
рН |
|||||||||||||
|
25 |
35 |
42 |
50 |
55 |
60 |
65 |
5,0 |
6,0 |
7,0 |
9,0 |
10,0 |
12,0 |
13,0 |
|
|
4 |
++ |
++ |
++ |
++ |
+ |
+ |
– |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
+ |
– |
|
15 |
++ |
++ |
++ |
+ |
+ |
– |
– |
++ |
++ |
++ |
+ |
– |
– |
– |
|
21 |
++ |
++ |
+ |
+ |
– |
– |
– |
++ |
++ |
++ |
+ |
+ |
– |
– |
|
24 |
++ |
++ |
++ |
++ |
+ |
+ |
– |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
+ |
– |
|
1 |
+ |
+ |
++ |
++ |
+ |
– |
– |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
+ |
|
8 |
++ |
++ |
++ |
+ |
– |
– |
– |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
+ |
– |
|
11 |
++ |
++ |
++ |
++ |
+ |
– |
– |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
+ |
– |
|
27 |
+ |
+ |
+ |
++ |
++ |
+ |
+ |
++ |
++ |
++ |
+ |
+ |
+ |
– |
|
30 |
+ |
+ |
++ |
++ |
+ |
– |
– |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
+ |
|
34 |
++ |
++ |
++ |
++ |
+ |
– |
– |
++ |
++ |
++ |
++ |
++ |
+ |
+ |
Примечание: – отсутствие роста; + – заметный рост; ++ – обильный рост.
Заключение
Изучен химический состав термальных вод из различных скважин месторождения Кульдур. Показано, что отличительной чертой этих вод является высокая температура, низкая минерализация и щелочные условия среды. Воды наиболее обогащены натрием, кремнием, хлором, фтором, литием, мышьяком и стронцием. Из термальных вод и микробных матов выделены 35 штаммов гетеротрофных бактерий, для которых изучены физиолого-биохимические свойства и потенциальная ферментативная активность. Отмечено, что среди выделенных штаммов в основном преобладали грамотрицательные, неподвижные, аспорогенные, каталазоположительные палочки различной длины. Культуры были способны к росту в широком диапазоне рН и температуры, утилизировали достаточно широкий спектр сахаров и спиртов бактерий и проявляли высокую амилолитическую, протеолитическую, липолитическую и более низкую лецитиназную внеклеточные ферментативные активности.
Полученные данные позволяют утверждать, что вода и бактериальные маты термальных источников Кульдур населены уникальным сообществом гетеротрофных термофильных микроорганизмов. Несомненно, что это бактериальное сообщество играет особую роль в функционировании гидротермальной экосистемы, в том числе и в биогеохимических преобразованиях, именно за счет своей высокой потенциальной метаболической активности.
Авторы выражают благодарность ген. директору санатория «Кульдур» С.Н. Гончарову и начальнику Кульдурской гидрогеологической станции санатория А.Л. Кравченко за предоставление возможности отбора проб и помощь при проведении исследований.