Флуктуирующая асимметрия (ФА) – это ненаправленное отклонение от нулевого значения величин билатеральных признаков при нормальном распределении разности этих признаков. Этот вид асимметрии относится к флуктуационной изменчивости, которая охватывает не только симметричные признаки, но и количественную изменчивость биомассы, окраски, биохимических и других функций как показателей генотипической нормы реакции и экологической толерантности. По величине индекса ФА судят о стабильности развития как отклонении от гомеостаза развития популяции. Однако есть мнение, что отклонение от симметрии, напротив, отражает повышение стабильности развития как усиления адаптации к изменяющимся условиям среды. Такая двойственность суждений заставляет рассматривать стабильность развития в филогенетическом аспекте, например в аспекте эволюции популяций [1].
Не менее 30 семейств высших растений обследовано на предмет поиска эффективных биоиндикаторов состояния окружающей среды [2; 3]. Неоднозначность результатов связана с кажущейся доступностью методик. Растения, особенно гомозиготные формы, удобны для таких исследований, а листовые пластины древесных пород – популярный объект определения стабильности развития [4]. Климатические условия, высотная поясность, антропогенное повышение температуры – наиболее важные факторы, которые принято учитывать при оценке флуктуации величин гомологичных парных признаков [5-7].
Представители рода Prunus широко распространены в Европе и за ее пределами. Ранее была изучена вариабельность морфологических признаков (формы и линейных параметров) листовых пластин Prunus avium L. [8; 9] и их флуктуирующая асимметрия [3]. На большей части территории России произрастает черемуха обыкновенная (Prunus padus L.) – древовидное, не образующее гибридов, тетраплоидное растение, ареал которого простирается на север до Кольского полуострова.
Листовые пластины черемухи имеют слабое дуговидное жилкование, часто с удлиненной правой половиной на абаксиальной поверхности, т. е. ее листья нельзя назвать строго симметричными, как и листья многих других деревьев, например вяза гладкого (Ulmus laevis Pall.). Несмотря на то что жилки листовых пластин P. padus не имеют четких окончаний, для определения величины их флуктуирующей асимметрии выбираются те же мерные признаки, что и для тестирования ФА березы повислой (Betula рendula L.), в частности ширина половинок листа.
Проверка на направленную асимметрию (НА) показывает ее отсутствие при достаточном объеме выборки, например 50-100 листьев. Численно индекс ФА определяют по абсолютной величине отношения разности величин признаков к их сумме. Таким образом, складывается представление о присутствии флуктуирующей асимметрии без примеси НА и стабильность развития популяции определяется только по одному признаку.
В настоящей работе дана апробация метода геометрической морфометрии для относительно несимметричных признаков, проведена оценка изменчивости формы листовых пластин и стабильности развития P. padus.
Материалы и методы исследования
Исследовано три популяции черемухи обыкновенной в урбанизированных биотопах площадью не менее 2-3 км2. Две из них располагались на расстоянии около 200 км друг от друга: в Московской (г. Электросталь, 55°48′ с. ш., 38°27′ в. д.) и Владимирской (56°08′00″ с. ш., 40°25′00″ в. д.) областях, третья была выбрана на Кольском полуострове (Мурманская область, г. Апатиты, экспериментальный участок ПАБСИ, 67°34′48′′ с. ш., 33°18′10′′ в. д.).
Листья собирались со всех сторон нижней части кроны, с последующим их отбором по величине. Использовались деревья или группы деревьев высотой от 6 до 15 м. Отбиралось по 7-9 листьев с 7 деревьев. Листья высушивались и через 2-3 дня сканировались вместе с мерной линейкой. Затем измерялась ширина правой и левой половинок листа экранным дигитайзером Dig2 из пакета серии TPS (Rholf, 2014). Две настоящие метки (true landmarks) выставлялись в основании и на апексе (верхушке) листовой пластины (рис. 1).
Края листовых пластин очерчивались в виде ломаной линии с выставлением 50 полуметок на каждой стороне. Ломаная линия наносилась с помощью 15-20 отметок с последующей разбивкой на равные сегменты. Разметка проводилась дважды на каждой стороне: по часовой стрелке и против нее, и координаты меток на каждой пластине регистрировались в виде файла TPS с координатами 102 меток четыре раза. После этого файлы объединялись, создавалось единое прокрустово пространство с множествами значений координат и в ковариационном анализе рассчитывались расстояния между ними (дистанции Махаланобиса).
Рис. 1. Две настоящие метки, левый и правый мерные признаки и 100 полуметок по контуру листовой пластины Prunus padus L. (TPSDig2)
Дисперсия координат наносимых на изображение меток включала компонент формы (симметричный) и компонент асимметричности, в виде флуктуирующей (ФА) и направленной асимметрии (НА) для определения объединяющих их различий.
Основным методом был аналог двухфакторного дисперсионного анализа с рандомным признаком «лист» и фиксированным – «сторона» (обобщенный прокрустов анализ, GPA). Величина ФА и НА определялись по индексу F-критерия Гудолла (аналог критерия Фишера). Предварительные статистические анализы выполнялись в среде Statistica 10 (Stat. Ink). GPA и ковариационный анализ выполнялись в программе MorphoJ (Klingenberg, 2011). Для нормализации выборочных значений использовалось пермутационное размножение значений 10 000 раз, принимался статистический уровень значимости 95%.
Результаты исследования и их обсуждение
Метод нормирующей разности
Деревья различались по размеру листовых пластин (F=25,7; p<<0,01). Так, в мурманской популяции критерий Фишера в однофакторном дисперсионном анализе составлял F=12,9, в то же время в московской и владимирской популяциях он был равен соответственно F=12,7 и F=3,5 (p<0,01), что говорит о наибольшей гетерогенности выборки с Кольского полуострова.
Длина листовых пластин в мурманской популяции была намного меньше, чем в популяциях средней полосы России (F=9.2; p=0,002). Стандартное отклонение от среднего (SD) в мурманской популяции составило SD=1,41; в московской – SD=0,93, во владимирской – SD=1,31. Результаты описательной статистики значений ФА представлены в таблице 1.
Величина ФА, полученная мерным способом по формуле нормирующей разности, по ширине половинок листа была относительно низкой и статистически различалась в трех популяциях (F=9,85; p=10-5). Во владимирской популяции высокий эксцесс (kurtosis) и скос (skewness) коррелировали с ростом дисперсии (variance), с высоким коэффициентом вариации (coef. var.), с максимальным значением ФА. В этой же популяции были и самые крупные листовые пластины.
Направленная асимметрия не выявлена (t-тест: р>0,05). Мерный признак ширины листовой пластины можно использовать для определения ФА, но ввиду того что признак единичный, он может давать приблизительное представление о стабильности развития.
Таблица 1
Описательная статистика листовых пластин
|
Популяция |
Длина листа, см |
FA |
|||||||
|
Mean |
Variance |
Coef. var. |
Stand. err. |
Skewness |
Std. err. skewness |
Kurtosis |
Kurtosis std. err. |
||
|
Мурманская |
6,62±0,01 |
0,024 |
0,0002 |
63,285 |
0,002 |
0,569 |
0,330 |
-0,845 |
0,650 |
|
Владимирская |
7,9±0,01 |
0,034 |
0,0009 |
87,576 |
0,004 |
1,563 |
0,330 |
3,736 |
0,650 |
|
Московская |
8,18±0,01 |
0,016 |
0,0001 |
62,176 |
0,001 |
0,342 |
0,337 |
-0,411 |
0,662 |
Метод геометрической морфометрии
Обозначенный метод, известный с конца девяностых годов ХХ века, основан на преобразовании формы биологического объекта путем симметричного отражения билатеральных структур с поворотом меток для усреднения формы и размера образцов в выборке. Консенсусная фигура (центроид) означает усредненную конфигурацию формы и величины образцов. Относительно нее и рассчитываются отклонения в дисперсии координат меток. Прокрустово пространство (Procrustes space), в котором находится центроид, используется для определения расстояний между множествами значений координат, в том числе значений координат, соответствующих билатеральной асимметрии. Антисимметрия – это равномерное доминирование каждой из сторон с отрицательной корреляцией между величинами признаков и отрицательным эксцессом в выборке. В листовых пластинах такой вид асимметрии встречается очень редко. Нормирование большим числом рандомных повторений значений, как правило, сглаживает проявление антисимметрии. Величина центроида – это квадратный корень из суммы отклонений меток от усредненного значения, таким образом, величина центроида не связана прямо с величиной самих листьев.
Размер консенсусного центроида снижается по мере увеличения размеров листовых пластин. Мы объясняем это снижением гетерогенности в выборках из трех популяций от мурманской до владимирской (табл. 2).
В мурманской популяции высокая гетерогенность длины листьев с малым значением среднего вызывала явное различие в величине центроида (F=9 462,3). Во владимирской популяции, несмотря на большую длину листьев, величина центроида была значительно меньше. Листовые пластины из мурманской популяции сильно различались по длине и, как показал прокрустов анализ, – по форме (табл. 3; первая строка).
Таблица 2
Длина листовых пластин и размер центроидной фигуры
|
Популяция / длина листа, см |
Effect |
SS |
MS |
df |
F |
|
Мурманская / 6,62 ±0,01 |
образец (1) |
3605,2 |
64,4 |
56,0 |
9462,3*** |
|
ошибка (2) |
0,83 |
0,01 |
122,0 |
||
|
Московская / 8,18 ±0,01 |
(1) |
2679,9 |
43,22 |
62,0 |
1232,8*** |
|
(2) |
6,63 |
0,04 |
189,0 |
||
|
Владимирская / 7,9 ±0,01 |
(1) |
16358,8 |
308,7 |
53,0 |
6,7*** |
|
(2) |
7347,5 |
45,92 |
160,0 |
Обозначения: Effect – источники вариации; SS – сумма квадратов; MS – средний квадрат; df – степень свободы; F – критерий Гудолла; *** – р<0,0001.
Таблица 3
Изменчивость формы, направленной асимметрии и ФА в прокрустовом анализе
|
Популяция |
Effect |
SS |
MS |
df |
F |
|
Мурманская |
образец (1) |
3,81 |
0,00 |
5600 |
22,13*** |
|
сторона (2) |
0,01 |
0,00 |
100 |
4,32*** |
|
|
образец×сторона, (1)×(2) |
0,17 |
0,00 |
5600 |
0,75ns |
|
|
ошибка (3) |
1,00 |
0,00 |
24400 |
||
|
Московская |
(1) |
2,21 |
0,00 |
6200 |
0,44ns |
|
(2) |
3,08 |
0,03 |
100 |
38,17*** |
|
|
(1)×(2) |
5,00 |
0,00 |
6200 |
8,16*** |
|
|
(3) |
3,73 |
0,00 |
37800 |
||
|
Владимирская |
(1) |
1,90 |
0,00 |
5300 |
0,35ns |
|
(2) |
6,35 |
0,06 |
100 |
61,9*** |
|
|
(1)×(2) |
5,44 |
0,00 |
5300 |
6,15*** |
|
|
(3) |
5,34 |
0,00 |
32000 |
Обозначения: Effect – источники вариации; SS – сумма квадратов; MS – средний квадрат; df – степень свободы; F – критерий Гудолла; *** – р<0,0001.
Рис. 2. Ординация компонентов формы (А) и асимметричности (Б) (зеленая – мурманская, синяя – владимирская, красная – московская популяции)
Направленная асимметрия (источник вариации «сторона») присутствовала во всех выборках с одинаковым уровнем значимости (р<0,0001). Флуктуирующая асимметрия отсутствовала в мурманской популяции (p>0,05) и проявлялась в двух других популяциях в малой доле, т. е. с низким значением F-критерия Гудолла.
Длина листовых пластин и ФА, полученная мерным способом, не коррелировала с изменчивостью формы листа. Например, в московской популяции были самые крупные листья, а во владимирской – самая высокая величина ФА на фоне несущественной изменчивости в форме листовых пластин.
Ковариационный анализ проводился для источника вариации «образец», объединенного в одну общую выборку. Этот анализ включает корреляционный и регрессионный методы и позволяет графически представить множества значений, отражающих как форму, так и асимметричность (НА+ФА) с расчетом прокрустовых расстояний, указывающих на различие между центрами множеств. На осях ОХ и ОУ располагаются канонические коэффициенты (CV1 и CV2). Они играют роль главных компонентов дисперсии и показывают ординацию (расположение) значений формы или асимметричности образцов из трех популяций (рис. 2).
Каждая точка означает образец листовой пластины с соответствующей величиной центроида, характеризующего как форму, так и асимметричность. Точки, относящиеся к мурманской популяции, лежат в отрицательной четверти коэффициентов (рис. 2А). Это говорит об обратной зависимости переменных формы от ее среднего значения.
На рисунке 2Б эллипсы, соответствующие владимирской и московской популяциям, находятся рядом в связи со сходством по асимметрии листовых пластин, главным образом направленной. Мурманская популяция лежит правее и большей частью в положительной четверти, следовательно, асимметрия здесь представлена положительной связью между дисперсией меток и средним значением асимметрии. Эллипсы формы и асимметрии располагаются в обратном порядке, что свидетельствует об обратной связи между их величинами. Большая изменчивость формы в мурманской популяции сопряжена с малой асимметричностью, тогда как в двух других популяциях низкой изменчивости формы сопутствуют более высокие значения асимметричности (табл. 2).
Морфогеометрические расстояния (дистанции Махаланобиса), рассчитанные с учетом эллиптического распределения, показывают, что по форме листовых пластин мурманская популяция наиболее удалена от других: 3,17 (мурманская-московская) и 3,03 (мурманская-владимирская). Асимметричность мурманской популяции также отличается от популяций средней полосы России, наиболее заметно от владимирской (2,03) (табл. 4).
Таблица 4
Расстояния Махаланобиса, полученные в каноническом вариационном анализе (CVA, р<0,001)
|
Форма |
Асимметрия |
||||
|
Популяция |
Московская |
Мурманская |
Популяция |
Московская |
Мурманская |
|
Мурманская |
3,17 |
Мурманская |
1,96 |
||
|
Владимирская |
2,34 |
3,03 |
Владимирская |
1,62 |
2,03 |
Таким образом, по форме и общей асимметричности северная популяция (мурманская) отличается от двух других и характеризуется высокой степенью изменчивости формы и слабо выраженной асимметрией листовых пластин.
Заключение
Широко распространенные виды, такие как черемуха обыкновенная, обладают широким диапазоном экологической валентности и нормы генотипической реакции, что позволяет им адаптироваться к экологическим факторам, включая факторы географической широтности и высотной поясности [3; 8].
Адаптация включает как изменчивость в форме листовых пластин, так и изменчивость асимметрии. На величину усредненного консенсуса и на изменчивость формы влияет гетерогенность длины листовых пластин, наиболее характерная для мурманской популяции. Большая величина центроида и его значительная изменчивость в этой популяции не сопряжена с высокой асимметрией: ни направленной, ни флуктуирующей.
Географически близкие популяции (владимирская и московская) схожи и по форме листовых пластин и по асимметрии и не обладают изменчивостью формы, что можно отнести к влиянию климата средней полосы.
В сравнительном аспекте мерный способ определения ФА прост и относительно надежен, но технически он недостаточно точен из-за формы края листа, когда надо определять точку с максимальной кривизной, а большая ошибка измерения сильно завышает величину ФА.
Использование геометрической морфометрии, по нашему мнению, целесообразнее для листовых пластин, не обладающих выраженной направленной асимметрией, зависящей от активности ауксина в меристемной ткани [10]. В то же время метод удобен для тестирования изменчивости формы и асимметричности, а также для более точного определения флуктуирующей асимметрии.