Почвенные липиды представляют собой сложную смесь соединений, растворяющихся в органических растворителях или их смесях. В состав этой фракции входят свободные жирные кислоты, полярные или неполярные липиды, стероиды, воски и смолы. Термин «липиды» в почвоведении пришел из области биохимии, где они относятся к сложным соединениям эфиров жирных кислот и спиртов (включая их производные).
Уровень содержания липидов в гумусово-аккумулятивных горизонтах почв зависит от степени гумификации и количества гуминовых кислот. Почвенные липиды играют важную роль в формировании структуры органического вещества почвы. Количество липидов в почвах с высокой степенью гумификации незначительно и составляет в среднем 3%. Тем не менее даже в небольших количествах липиды выполняют важные функции в почвах, включая влияние на способность почвенных частиц абсорбировать вещества, скорость разложения органического материала и энергетические процессы, структуру и функционирование микробного комплекса [1].
Ранее было отмечено, что растения влияют на содержание и играют важную роль в поставке липидов в почву [1; 2]. Следовательно, количество и характеристики растительных остатков имеют основное значение для содержания липидов в почве. Компоненты липидов в почве могут быть изменены различными факторами, такими как тип растительности, содержание углерода органического и влаги в почве, условия использования земель [3; 4].
В верхних горизонтах почв содержание липидов на 2–3 порядка меньше содержания органического вещества. Липиды в почвах обычно распределены таким образом, что их концентрация резко уменьшается по мере проникновения вниз, практически достигая нулевых значений в почвообразующих породах. Самые плодородные почвы обычно бедны липидами. Присутствие липидов может даже быть связано с содержанием гумуса, а также аэрацией почвы. Стабильность содержания липидов в почвах связана с их устойчивостью и имеет важное значение для определения процессов формирования почвы.
Различные исследования показывают, что содержание липидов может иметь влияние на распределение углерода между компонентами микробиоты почвы. Состав липидов также определяет характеристики энергетических потоков между разными уровнями трофической цепи в экосистеме [5; 6]. В качестве примера можно привести научное исследование, где сравнивалось содержание липидов и углерода в почвах лесных насаждений разного возраста с помощью специальных методов анализа. Было обнаружено, что присутствие липидов непосредственно связано с содержанием углерода в почве. Существует очень высокая корреляция между данными по содержанию липидов и общим содержанием органического вещества, а также содержанием растворенного органического вещества, с коэффициентом корреляции Пирсона, превышающим 0,998. Было обнаружено наибольшее количество липидов в почвах, где прошло более двух столетий с начала роста деревьев. В почвенных образцах, взятых с обрабатываемых полей, которые граничат с лесными полосами различного возраста, содержание липидов и углерода было одинаково и значительно ниже, чем в почве лесополос [7].
Изучение липидной фракции органического вещества в мерзлотных почвах Забайкалья, которое ранее не проводилось, является актуальной задачей.
Цель исследования заключается в анализе структуры и состава липидной фракции органического вещества в черноземах квазиглеевых юга Витимского плоскогорья в Западном Забайкалье с использованием элементного анализа и метода 13С–ЯМР.
Материалы и методы исследования
Для данного исследования были выбраны черноземы квазиглеевые, расположенные в Еравнинской котловине юга Витимского плоскогорья в Западном Забайкалье.
В Еравнинской котловине встречается чернозем квазиглеевый, который можно назвать полугидроморфным аналогом черноземов, развивающимся в автоморфных условиях. Характеристики почв свидетельствуют о высоком плодородии, высоком содержании карбонатов и наличии признаков оглеения в нижних горизонтах и материнской породе. Гидроморфизм данных почв связан с близким расположением мерзлоты.
Характеристика температурного режима исследуемых почв указывает на их принадлежность к мерзлотному типу. Вследствие этого уровень теплообеспеченности данных почв является недостаточным, особенно весной и ранней осенью. Мерзлота создает специфичный водный режим, когда доступ влаги грунтовых вод ограничен и количество осадков полностью определяет уровень влагоснабжения. У мерзлотных черноземов в начале лета, особенно в период засушливых лет, наблюдается недостаток влаги в верхних слоях почвы. Однако этот недостаток существенно снижается благодаря освобождению влаги при оттаивании. Тип водного режима этих почв относится к типу, который характеризуется как периодически промывной.
Криогенные процессы изменяют состояние почвы и приводят к формированию уникальных характеристик в ее структуре, свойствах и функционировании. Среди негативных последствий мерзлоты для почвы можно отметить потерю гумуса в корнеобитаемом слое растений из-за различных мерзлотных процессов и явлений. На биопродуктивность почв оказывает влияние многолетняя мерзлота, действующая как холодный экран.
Физико-химические параметры исследуемых почв нами опубликованы ранее [8; 9].
Была использована стандартная техника экстрагирования в аппарате Сокслета с помощью 200 мл азеотропной смеси спирта с бензолом в соотношении 1:2 по объему для извлечения липидов из почвы [10]. Навеска почвы составляла 20 г и помещалась в патрон из фильтровальной бумаги. Использование специальной смеси может ускорить процесс извлечения липидов из почвы и сократить расход растворителя. Экстрагирование проводится в течение 24 часов. В среднем окрашивание свежих порций растворителя обычно заканчивается в течение 12 часов. Однако из-за того, что не все компоненты липидов окрашены, время экстракции увеличивается до 24 часов для всех типов почв. Это дает возможность получить сопоставимые результаты, не учитывая наличие окрашенных компонентов в составе липидов. Затем основная часть растворителя удаляется с помощью роторного испарителя, а препарат высушивается до воздушно-сухого состояния.
Исследование структурных компонентов препаратов липидов (спектры 13С-ЯМР) определено методами ядерного магнитного резонанса на ЯМР-спектрометре Bruker АV-600 (резонансные частоты 600,18 МГц – 1Н и 150,93 МГц – 13С), снабженном датчиком с катушкой для подачи Z-градиентных импульсов.
Для исследования всё количество предоставленной пробы растворяли в 520 мкл дейтерированного хлороформа (СDСl3) и помещали в 5-мм ЯМР-ампулу. После исследования раствор помещался в исходный эппендорф, растворитель испарялся на воздухе.
Записывали спектры магнитного резонанса на протонах (ЯМР 1Н) и на ядрах углерода-13 с подавлением спин-спинового взаимодействия с протонами (ЯМР 13С). Использовали импульсные программы фирмы Bruker – zg30 и zgpg.
Элементный состав липидов в препаратах определен с помощью прибора CHNS/O Series 2 компании Perkin Elmer.
Результаты исследования и их обсуждение
Большинство методов определения химической природы природного органического вещества в почве, отложениях и воде требует предварительных этапов экстракции или концентрирования, которые не являются количественными и создают артефакты. Анализ ядерного магнитного резонанса (ЯМР) с 13С позволяет избежать этих проблем. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в настоящее время является стандартным аналитическим методом, который применяется различными способами для изучения липидов. ЯМР позволяет исследовать молекулярные структуры, которые могут принимать липиды, их молекулярный порядок и динамику. Информацию можно получить с минимальным химическим возмущением, хотя присущая ЯМР низкая чувствительность может иметь практические ограничения [11]. ЯМР используют в качестве инструмента для выявления молекулярных подробностей о липидах во многих различных полиморфных формах и формах образцов, а также чтобы понять термодинамическое поведение, молекулярные взаимодействия с другими компонентами мембраны, ионами и влияние рН на свойства липидов. Присущая этому методу нечувствительность, по сравнению с некоторыми другими биофизическими методами, частично перевешивается отсутствием химических возмущений при наблюдении либо естественно видимых изотопов ЯМР, либо посредством не возмущающего мечения [11]. Молекулярная характеристика почвенных липидов дает ценную биогеохимическую информацию о влиянии растительности, микроорганизмов и абиотических факторов на процесс депонирования почвенного углерода. Липиды почвы ведут себя как биомаркерные фракции почвы при анализе с помощью 13C-ЯМР в целом [12].
Полученные 13C-ЯМР-спектры для чернозема квазиглеевого приведены на рисунке 1. Спектры ЯМР 13С регистрировались в диапазоне от -10 до 240 м.д. относительно тетраметилсилана. Намагниченность ядер углерода индуцировали 90° импульсом, время, которое занял спад свободной индукции, 0.87 секунды, время задержки для релаксации 5 с. Длительность одного эксперимента ЯМР составляла от 7.2 до 6.5 часов. Для калибровки спектров использовался сигнал дейтерированного растворителя (СDСl3, 77.0 м.д.).
Для улучшения соотношения «сигнал – шум» было использовано два варианта обработки зарегистрированных сигналов спада свободной индукции. В первом варианте сигналы были умножены на спадающую экспоненту с параметром уширения спектральной линии (lb) 10 Гц, чтобы уменьшить перекрытие сигналов. Во втором варианте параметр уширения спектральной линии (lb) был установлен на 100 Гц, чтобы лучше наблюдать широкие группы сигналов. С помощью дальнейшего использования преобразования Фурье был осуществлен переход от временной развертки сигнала к частотной развертке, измеряемой в миллионных долях от частоты спектрометра.
Выравнивание базовой линии проводили с использованием линейной функции. Выполняли интегрирование интенсивности групп сигналов, расположенных в отдельных областях спектра, деление на которые проводили в соответствии с литературными аналогиями характерных спектральных областей различных структурных фрагментов [13; 14]. Сигнал растворителя (75-79 м.д. для lb=10 Гц) исключали из интегрируемой области.
Необходимо отметить, что условия регистрации не позволяют использовать интегральные интенсивности в спектрах ЯМР 13С для количественного измерения состава проб, поскольку не проводились исследования влияния различий в скорости Т1 релаксации, а также для усиления сигналов углерода использовался эффект Оверхаузера. Однако интегральные интенсивности возможно использовать для сравнения спектров двух проб, полученных в тех же условиях регистрации.
Отнесения сигналов в спектрах 13С органического вещества почв рассматривается в обзоре [14]. Для исследуемых проб в спектрах приняты следующие отнесения согласно [13].
На рисунках 1 и 2 спектры всех исследуемых проб приведены в одной шкале химических сдвигов. Как можно видеть, спектры всех проб схожи между собой: наблюдаемые сигналы расположены в широкой спектральной области (от ~10 до ~180 м.д.), в области углеродов алифатических фрагментов рисунок максимумов сигналов совпадает.
Рис. 1. Спектр ЯМР 13С препаратов липидов черноземов квазиглеевых Взвешивающая функция для сигнала ССИ – экспонента, LB=10 Гц
Рис. 2. Элементный состав препаратов липидов черноземов квазиглеевых (n=3)
В спектре ЯМР 13С препарата липида чернозема квазиглеевого наблюдаются выделяющиеся на фоне других сигналов два относительно интенсивных узких сигнала 14.1 и 61.6 м.д., а в спектре ЯМР 1Н имеются относительно интенсивный триплет 1.35 м.д. и квартет 4.35 м.д. Это указывает на наличие этокси-группы, входящей в состав сложных эфиров.
Совместный анализ спектров ЯМР 1Н и ЯМР 13С, а также рассмотрение ближних корреляций (НSQC) позволяет определить ещё несколько характерных сигналов.
В спектрах ЯМР 1Н препаратов липидов чернозема квазиглеевого имеется пара самых слабопольных мультиплетов примерно равной интенсивности ~7.5 и ~7.7 м.д. Данные сигналы дают корреляционные кросспики с сигналами углерода 128.9 и 130.9 м.д., для которых наблюдается ещё один характерный сигнал данной группы – 156.2 м.д (=С-ОR). Этот набор сигналов возможно отнести к производным фенолов, содержащих заместитель в пара-положении.
В спектрах ЯМР 1Н всех исследованных проб имеется группа сигналов ~5.3 м.д., коррелирующих с углеродами ~129.7 м.д. Химические сдвиги данных сигналов позволяют предположить их отнесение к алкеновым частям алифатических фрагментов молекул.
В препарате липида чернозема квазиглеевого содержание алифатических фрагментов относительно суммарного содержания ароматических фрагментов достаточно высокое.
Ранее проведенные исследования указывают на связь между липидными компонентами и гидроморфизмом почвы [15]. Предположительно, если усилить степень гидроморфизма, то доля непредельных компонентов увеличится. Это согласуется с результатами исследований Е.Д. Лодыгина и В.А. Безносикова [15]. Причина такого явления – слабый процесс разложения растительных остатков с ароматическими структурами лигнина в полугидроморфных почвах.
Содержание углерода и водорода в липидной фракции почвенного органического вещества в слое 10–20 см уменьшилось (рис. 2), в то время как доля азота и кислорода увеличилась. Отношение H/С, которое указывает на ароматичность препаратов, увеличилось с 0,8 в слое 0–10 см до 1,5 в слое 10-20 см. Эти результаты свидетельствуют о том, что липидная фракция в гумусово-аккумулятивном горизонте черноземов квазиглеевых имеет алифатическую природу.
Заключение
Анализ 13С-ЯМР-спектров липидов и их сравнение с теоретическими 13С-ЯМР-спектрами жирных кислот и их эфиров позволяют предположить, что большая часть липидов, обнаруженных в почве, состоит из жирных кислот и их эфиров. Это факт объясняет, почему основная часть атомов углерода (более 90%) в молекулярной структуре липидов представлена алифатическими цепочками.
В черноземах квазиглеевых обнаружена зависимость между липидными компонентами и гидроморфизмом почвы. Возможно, увеличение гидроморфизма будет сопровождаться увеличением количества компонентов, которые не являются предельными. Элементный состав препаратов липидов черноземов квазиглеевых показал преобладание алифатической структуры.