Введение
Одно из основных направлений биологизации сельского хозяйства связано с поиском новых продуцентов и биопрепаратов, направленных на увеличение продуктивности сельскохозяйственно значимых культур. Несмотря на многообразие известных стимуляторов роста растений, этот вопрос остается одним из приоритетных, поскольку связан с продовольственной безопасностью и защитой окружающей среды.
Среди различных ростостимулирующих препаратов наиболее часто рассматриваются препараты, функционирующие на основе бактерий. Среди них такие препараты, как Фитоспорин, Ризобакт, Биофил, Агрофил и др. [1].
Новым направлением в поиске ростостимулирующих препаратов являются исследования, связанные с использованием лектинов микроорганизмов. Лектины – это белки или гликопротеины, обладающие гемагглютинирующей активностью, способные к взаимодействию с поверхностными структурами клеток. Для лектинов показано, что они принимают участие в процессе распознавания вирусных, бактериальных, микоплазменных и паразитарных инфекций, а также при метастазировании рака, росте и дифференцировке клеток [2–4]. Однако значительное число данных исследований связано с использованием лектинов растений [5]. В настоящее время установлено, что многие функции, выполняемые лектинами растений, характерны и для лектинов микроорганизмов. В этом отношении хорошо изучены бациллы, псевдомонады, азоспирилы [6–8]. Исследований, связанных с лектинами микромицетов, значительно меньше.
Лектины микромицетов были описаны как химиотерапевтические агенты, митогены и средства доставки лекарств к необходимым мишеням [9]. Для некоторых из них установлена антибактериальная, инсектицидная, противовирусная активность [10–12].
Действие лектинов микромицетов на растительные объекты отражено в небольшом количестве опубликованных работ, в основном связанных с защитой растений от насекомых. Инсектицидные свойства лектинов грибов установлены у ряда грибов-базидиомицетов, дикариотических грибов, у маннозо-специфичного лектина из Penicillum chrysogenum и лектина Phytophthora parasitica [13–15].
Ростостимулирующее действие поверхностных лектинов Fusarium solani установлено на всхожесть и рост гороха [16]. Для лектинов других микромицетов данные работы не проводились.
Среди наиболее распространенных в природе микромицетов активно изучаются в настоящее время грибы рода Alternaria. Данный род включает как сапрофитные, так и фитопатогенные грибы. Установлено, что многие из них способны к образованию различных биологически активных соединений [17]. Однако способность данных микроорганизмов к синтезу лектинов была установлена только в последнее время [18]. Поскольку данные микромицеты, как и микромицеты рода Fusarium, способны к синтезу лектинов, было решено исследовать их действие на растительные объекты.
Цель исследования – изучение действия различных концентраций лектина микромицета рода Alternaria на энергию прорастания, всхожесть и ростовые процессы зерновых культур.
Материалы и методы исследования
В работе использовали штамм микромицета Alternaria alternata 4 музея кафедры биотехнологии Первого государственного медицинского университета им. И. М. Сеченова.
Культивирование микромицета осуществляли на картофельном отваре с добавлением глюкозы, жидкофазным методом, при периодическом культивировании в стационарных условиях роста. Температура культивирования 28 ºС.
Для получения лектинов использовали экстракты 6-суточного мицелия гриба Alternaria alternata 4. Мицелий собирали фильтрованием с помощью промышленной ткани, маркировки (полиэтилентерефталат) для лабораторного биопроцессинга фирмы «АкваАналитикс Техника». После чего собранный мицелий тщательно промывали стерильной дистиллированной водой, а затем 20 мМ Tris-HCl буфером (рН 7,2), с последующей гомогенизацией в данном буфере при соотношении 1:1. Гомогенизацию производили на размольной гарнитуре ESSA марки В800 компании «АМТЕХ». Полученный гомогенат оставляли при перемешивании в течение 5–6 ч при температуре 4 °С. Затем осадок отделяли центрифугированием в течение 10 мин при 5000 g, 4°С. Полученный супернатант анализировали на присутствие белка и лектинов.
Белок определяли по методу Бредфорда [19, с. 183], активность лектинов – реакцией агглютинации с нативными эритроцитами человека I группы крови. В работе использовали 2 %-ную суспензию эритроцитов, полученную по методу Луцика с соавт. [20, с. 13].
В работе с растениями использовали лектин микромицета Alternaria alternata 4, в виде суммарного белка, осажденного сульфатом аммония 65 % из клеточного экстракта мицелия гриба и содержащего лектин в концентрации 67–70 %.
Действие лектинов Alternaria alternata 4 в различных концентрациях изучали на зерне озимой пшеницы «Казанская 560». Перед посевом семена растений предварительно стерилизовали 2 %-ным перманганатом калия в течение 15 мин, после чего многократно промывали дистиллированной водой.
В экспериментах определяли энергию прорастания и всхожесть семян. Для определения ростовых показателей использовали морфометрические данные: длину корней и побегов, число корней и их сырую биомассу. Все эксперименты проводились в трех повторностях, с учетом необходимого количества исследуемых семян.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили путем определения средних арифметических значений и их стандартных ошибок, используя стандартный пакет программ Microsoft Office Excel 2013. Достоверность разницы между сравнимыми величинами оценивали по критерию Стьюдента. Статистически значимыми считали различия при 95 % доверительной вероятности (p ≤ 0,05).
Результаты исследования и их обсуждение
Для оценки влияния мицелиальных лектинов микромицета Alternaria alternata 4 на энергию прорастания и всхожесть семян пшеницы проводили их обработку в течение 24 ч, с последующим распределением на поверхности, увлажненной стерильной водой, фильтровальной бумаги, в чашках Петри. В работе использовали лектин в концентрации 5, 10, 20, 40, 80 и 400 мкг/мл. Выбор концентраций был основан на ранее проведенных исследованиях по лектинам грибов и бактерий [21, с. 106; 22]. Контролем, служили образцы семян, которые замачивались в 20 мМ трис-HCl буфере (рН 7,2). Определение энергии прорастания устанавливали на 3-е сутки после обработки семян лектином, всхожесть регистрировали через 7 дней, что соответствует принятым временным значениям для данного вида семян (табл. 1).
Таблица 1
Влияние лектина Alternaria alternata 4 на энергию прорастания, всхожесть семян пшеницы
|
Варианты опыта |
Концентрация лектина, мкг/мл |
Энергия прорастания, % |
Всхожесть, % |
|
Контроль |
0 |
68,5 |
74,0 |
|
Лектин Alternaria alternata 4 |
5 |
69,4 |
76,3 |
|
10 |
82,3 |
86,6 |
|
|
20 |
81,9 |
87,9 |
|
|
40 |
69,7 |
84,9 |
|
|
80 |
68,2 |
73,8 |
|
|
400 |
0 |
0 |
Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.
Рис. 1. Длина корней и побега на 10-й день выращивания пророщенных семян пшеницы, обработанных лектином Alternaria alternate 4 Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования
Проведенные исследования показали положительное влияние лектина Alternaria alternata 4 на энергию прорастания и всхожесть семян зерновых культур, в концентрациях 5–40 мкг/мл. Лучшие результаты были получены при обработке семян пшеницы лектином в концентрации 10 и 20 мкг/мл, когда энергия прорастания и всхожесть семян увеличивалась на 7–14 % относительно контроля. Более низкие и более высокие концентрации лектина (5 и 40 мкг/мл) увеличивали энергию прорастания и всхожесть семян, но в меньшей степени. Повышение концентрации лектина в растворе до 80 мкг/мл не вызывало увеличения стимулирующего действия на семена, а концентрации 400 мкг/мл тормозили всхожесть. Однако ингибирующее действие лектина было обратимым: семена, промытые и помещенные в водный раствор, полностью восстанавливали свою всхожесть. Такое действие лектинов азоспирилл на семена пшеницы отмечалось в работах Никитиной с соавт. [23]. Данные результаты показали, что концентрация лектина играет важную роль при воздействии лектина на растения и имеет дозозависимый эффект.
Для оценки влияния лектина микромицета Alternaria alternata 4 на рост и развитие растений мы обрабатывали 3-суточные проросшие семена пшеницы лектином в концентрации 5, 10, 20, 40 мкг/л. Обработку вели в течение 24 ч. Контролем служили образцы проросших семян, которые замачивались в 20 мМ трис-HCl буфере (рН 7,2).
Результаты исследований показали, что обработка семян лектином Alternaria alternata 4 оказывала положительное действие и на морфометрические показатели растений (рис. 1). Обработка семян пшеницы лектином Alternaria alternata 4 в концентрации 5 мкг/мл усиливала рост корней и зародышевого побега растения в 1,3 раза по сравнению с контролем. По мере увеличения концентрации лектина до 10 мкг/мл положительный эффект был более выраженным: увеличилось количество корней и их длина (в 2,7 раза), зародышевые побеги были длиннее и утолщеннее (в 1,9 раза) по сравнению с контролем. При обработке семян растений лектином в концентрации 20 мкг/мл общая картина увеличения корней и побега сохранялась (корни увеличивались в 2,5 раза, побеги – в 1,8 раза). При обработке семян растений лектином в концентрации 40 мкг/мл длина корней и побегов увеличивалась, но сохранялась на уровне, соответствующем обработке при 20 мкг/мл (рис. 2).
Полученные данные по увеличению длины корней и побегов пшеницы после обработки семян лектином Alternaria alternata 4 подтверждаются данными по определению их биомассы (табл. 2).
Определение биомассы корней пшеницы показало, что наибольшее количество биомассы образуется при обработке проросших семян лектином Alternaria alternata 4 в концентрации 10 и 20 мкг/мл, в данных вариантах опыта количество биомассы корней пшеницы возрастало в 2,3–2,5 раза, а биомасса побегов – в 3,3–4,0 раза.
1) 2)
Рис. 2. Обработка проросших семян пшеницы лектином Alternaria alternata 4: 1 – контроль (без обработки лектином), 2 – обработка лектином в концентрации 10 мкг/мл Примечание: составлен авторами по результатам данного исследования
Таблица 2
Биомасса корней и побегов пшеницы на 10-й день выращивания растений после обработки лектином Alternaria alternata 4
|
№ |
Концентрация лектина, мкг/мл |
Биомасса корней, г/15 растений |
Биомасса побегов, г/15 растений |
|
1 |
Контроль |
0,70±0,02 |
0,30±0,02 |
|
2 |
5 |
1,21±0,02 |
0,60±0,04 |
|
3 |
10 |
1,72±0,04 |
1,22±0,02 |
|
4 |
20 |
1,63±0,04 |
0,98±0,04 |
|
5 |
40 |
1,62±0,04 |
0,87±0,04 |
Примечание: составлена авторами на основе полученных данных в ходе исследования.
Выводы
Полученные результаты показали, что лектины Alternaria alternata 4 в концентрации 10 и 20 мкг/мл стимулируют энергию прорастания (на 13–14 %), всхожесть семян зерновых культур (на 13–14 %), а также обладают ростостимулирующим действием на развитие корней (в 2,5–2,7 раза) и побегов зерновых культур (в 1,8–1,9 раза). Несмотря на то, что эффективное действие препарата на семена и растения приходится на концентрации 10 и 20 мкг/мл, лучшие показатели в исследованиях соответствуют концентрации лектина 10 мкг/мл, которую можно рекомендовать для использования.
Заключение
Согласно проведенным исследованиям, лектин микромицета Alternaria alternata 4 можно отнести к разряду биологически активного препарата. В исследованиях было показано, что лектин микромицета рода Alternaria, особенно в концентрации 10 мкг/мл стимулировал все показатели, характерные для всхожести семян, роста и развития растений. Благоприятное действие лектинов на развитие растений способствовало увеличению длины корней и побегов пшеницы, а также к накоплению растительной биомассы, что напрямую связано с повышением урожайности культур. Действие лектинов Alternaria alternata имеет дозозависимый эффект, но высокие концентрации не приводят к гибели растений, что говорит о возможности использования исследуемых лектинов в растениеводстве.