Введение
Загрязнение агроценозов тяжелыми металлами, в частности свинцом, является одной из актуальных экологических проблем, оказывающей негативное влияние на рост, развитие и качество сельскохозяйственных растений [1, 2]. Свинец, поступающий в окружающую среду преимущественно из техногенных источников, способен подавлять ключевые физиологические процессы, такие как фотосинтез и поглощение воды, а также нарушать баланс питательных элементов в растениях [3]. Устойчивость растительных организмов к токсическому действию тяжелых металлов варьирует в зависимости от видовых особенностей, условий минерального питания и наличия стресс-протекторных веществ [4, 5]. В связи с этим исследование влияния различных форм азотного питания, включая аммонийную, на устойчивость Trifolium pratense к токсиканту – сульфату свинца представляется актуальной задачей для разработки агротехнических приемов, направленных на снижение негативных последствий загрязнения тяжелыми металлами.
Цель исследования – оценка влияния азотного и аммонийного питания на устойчивость Trifolium pratеnse к сульфату свинца. Полученные результаты могут быть использованы для разработки рекомендаций по применению удобрений для повышения устойчивости клевера к токсичным веществам, а также для оптимизации условий выращивания этой культуры. Исследование влияния азотного и аммонийного питания на устойчивость клевера к сульфату свинца является важной задачей в области сельского хозяйства и экологии.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования служили 14-суточные проростки клевера лугового. Растения по 20 шт. в каждом варианте культивировали методом водной культуры на светоплощадке в условиях контролируемого микроклимата: освещенность 150 кЛк, фотопериод 14 ч, температура воздуха +29 °C, влажность 80–90 %.
Семена стерилизовали 5% раствором гипохлорита натрия с последующим промыванием и проращивали в термостате при +27°C. Равномерно проросшие семена переносили на вегетацию [6, 7].
В качестве источников азота использовали нитрат калия (KNO₃, хч.) и сульфат аммония ((NH₄)₂SO₄, хч.): NO₃⁻-растения – нитратный источник азота, NH₄⁺-растения – аммонийный источник азота.
На 7-е сутки вегетации в часть сосудов вносили PbSO4 хч. для создания свинцового стресса. Концентрация свинца составляла 100 µM [8]. Контрольные растения выращивали на дистиллированной воде. На 14-е сутки измеряли морфологические показатели: длину побега, сырую и сухую массу побега и корня. Оводненность тканей рассчитывали по формуле
Оводненность = (сырая масса – сухая масса) / сухая масса [9].
Биохимический анализ включал определение активности ферментов антиоксидантной системы: активность гваяколпероксидазы определяли спектрофотометрически при 436 нм [10]; активность каталазы оценивали спектрофотометрически при 410 нм по методу М. А. Королюк и др., 1988 [11].
Опыт выполняли в трехкратной повторности. Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета Microsoft Office Excel [12].
Результаты исследования и их обсуждение
Исследование влияния различных источников азота (NO₃⁻, NH₄⁺) на 14-суточные проростки Trifolium pratense не выявило статистически значимых различий в сырой и сухой массе побегов и корней между вариантами опыта в контроле (рис. 1–4). Средние значения сырой массы побегов и корней составили 5,41±1,25 мг и 2,04±0,6 мг, сухой массы – 4,35±0,25 мг и 1,73±0,7 мг соответственно.
Однако анализ структуры биомассы позволил выявить существенные физиологические различия. У растений, выращенных на нитратном азоте (NO₃⁻), наблюдалась тенденция к формированию более оводненных тканей: отношение массы воды к сухой массе в побегах у них составляло 0,25±0,06 мг/мг, что в 1,8 раза превышало аналогичный показатель у растений аммонийного варианта (NH₄⁺) – 0,14±0,05 мг/мг. Более высокая оводненность тканей при нитратном питании, вероятно, связана с накоплением ионов NO₃⁻ и K⁺ в вакуолях в качестве осмотически активных веществ, что усиливает приток воды в клетки. Аммонийное питание, напротив, требует больших энергетических затрат на компартментацию ионов NH₄⁺ в вакуолях или их быструю ассимиляцию в аминокислоты, что может ограничивать накопление осмолитов и, как следствие, снижать оводненность тканей [13].
Присутствие в питательной среде сульфата свинца (Pb) индуцировало стрессовый отклик, выразившийся в ингибировании ростовых процессов. Наиболее существенное снижение сырой массы (в 1,3 раза относительно контроля) зафиксировано у растений на фоне аммонийного питания (NH₄⁺ + Pb). Нитратный вариант (NO₃⁻ + Pb) проявил несколько большую устойчивость, демонстрируя снижение сырой массы лишь в 1,1 раза (рис. 1, 2).
Рис. 1. Изменение сырой массы побега клевера в зависимости от источника азотного питания Примечание: составлен автором по результатам данного исследования
Рис. 2. Изменение сырой массы корня клевера в зависимости от источника азотного питания Примечание: составлен автором по результатам данного исследования
Ионы тяжелых металлов, включая свинец, нарушают водный обмен, вызывая водный дефицит, и растения с изначально более высоким осмотическим потенциалом (в данном случае на нитратном питании) способны лучше противостоять такому стрессу [14].
Измерение линейных параметров подтвердило общую тенденцию: максимальная длина побегов (33 мм) и корней (31 мм) отмечена при нитратном питании (рис. 5, 6). Воздействие свинца привело к дифференцированному отклику: в варианте NO₃⁻ + Pb длина корней превышала контрольный показатель в 1,3 раза, что может интерпретироваться как компенсаторная реакция, направленная на увеличение поглощающей поверхности. В то же время аммонийный фон (NH₄⁺ + Pb) усиливал ингибирующее действие токсиканта на ростовые процессы.
Рис. 3. Изменение сухой массы побегов клевера в зависимости от источника азотного питания Примечание: составлен автором по результатам данного исследования
Рис. 4. Изменение сухой массы корней клевера зависимости от источника азотного питания Примечание: составлен автором по результатам данного исследования
Характер изменения активности ключевых оксидоредуктаз – гваяколпероксидазы (GPO) и каталазы – имел тканеспецифичную и зависимую от формы азота направленность.
Наиболее высокая активность гваяколпероксидазы зарегистрирована в корнях NO₃⁻-растений (105 ОЕ/мг белка). Смена азотного источника на аммонийный приводила к перераспределению активности: в побегах она возрастала в 1,2 раза, а в корнях снижалась в 1,3 раза. Свинцовый стресс вызвал разнонаправленные изменения: при нитратном питании активность GPO в корнях снижалась, а при аммонийном – возрастала в 1,2 раза. В побегах наблюдалась противоположная реакция: активность фермента увеличивалась в варианте NO₃⁻ + Pb и существенно снижалась (с 23 до 14 ОЕ/мг белка) в варианте NH₄⁺ + Pb. Такая дифференцированная реакция пероксидазной системы связана с перераспределением защитных функций между органами в зависимости от типа азотного метаболизма, что модулирует ответ на стресс, вызванный тяжелым металлом.
Рис. 5. Изменение длины побегов клевера в зависимости от источника азотного питания Примечание: составлен автором по результатам данного исследования
Рис. 6. Изменение длины корней клевера в зависимости от источника азотного питания Примечание: составлен автором по результатам данного исследования
Активность каталазы, ключевого фермента детоксикации перекиси водорода, была максимальной в побегах. Ее минимальная базальная активность отмечена у NO₃⁻-растений (0,46 ОЕ/мг белка). Аммонийное питание вызывало повышение этого показателя в 1,1 раза, что коррелирует с потенциально высоким уровнем генерации активных форм кислорода при ассимиляции NH₄⁺. Воздействие свинца привело к резкой (в 1,7 раза) индукции каталазной активности в побегах NO₃⁻-растений, тогда как на аммонийном фоне значимого усиления не происходило. В корнях всех вариантов свинцовый стресс сопровождался подавлением каталазной активности, что указывает на возможное смещение путей нейтрализации H₂O₂ в сторону аскорбат-глутатионового цикла или пероксида [15]. Активация антиоксидантных ферментов, в частности каталазы и пероксидаз, является ключевым звеном в формировании устойчивости растений к окислительному стрессу, индуцированному тяжелыми металлами [16].
Заключение
Морфологический статус проростков Trifolium pratense формируется не только общей биомассой, но и ее структурой. При отсутствии значимых различий в сырой и сухой массе между контрольными растениями на разных источниках азота (NO₃⁻, NH₄⁺) установлено, что нитратное питание приводит к формированию тканей с высокой оводненностью, что указывает на существенное влияние формы азота на водный и осмотический статус растения.
Анализ активности антиоксидантных ферментов выявил четкую зависимость от типа азотного питания и принадлежности к определенному органу. При использовании нитратного источника азота свинцовый стресс сопровождался наиболее выраженным повышением активности каталазы в побегах (в 1,7 раза), тогда как в корнях всех опытных вариантов данный показатель снижался. Для гваяколпероксидазы была характерна смена активности: в варианте с нитратным питанием и добавлением свинца (NO₃⁻ + Pb) зафиксировано увеличение активности фермента в побегах при ее снижении в корнях. На аммонийном фоне (NH₄⁺ + Pb) наблюдалась противоположная тенденция – активация пероксидазы в корнях и подавление в побегах. Полученные данные позволяют заключить, что форма азотного питания выступает в роли важного модулирующего фактора, определяющего стратегию антиоксидантной защиты растений клевера лугового в условиях загрязнения среды ионами свинца.