В предыдущих сообщениях [1,5] было дано описание нейроэндокринных нейронов МК, впервые выявленных нами на его территории, а также приведены сведения о происходящих в них перестройках между стадиями эструс и метэструс эстрального цикла. Полученные результаты позволили высказать предположение о наличии гормон-зависимой реверсии в структурно-функциональной организации нейроэндокринных нейронов, происходящей под влиянием половых стероидов. Для уточнения высказанного предположения, мы провели изучение характеристик нейронов дорсомедиального ядра (Med) на стадии диэструс.
Материал и методы. Исследования проведены на 15 самках крыс половозрелого возраста линии Вистар, весом тела 200-250 г с регулярным эстральным циклом. Стадии эстрального цикла определяли по цитологической картине влагалищных мазков. Животных декапитировали на стадии диэструс. Для изучения цитологических характеристик нейронов при световой микроскопии мозг 7 крыс фиксировали в 10% -ном формалине, заливали в парафин и готовили 7-10 мкм. фронтальные срезы, которые окрашивали по Эйнарсону на нуклеиновые кислоты. Число «темных» и «светлых» клеток в Med подсчитывали в пяти полях зрения у каждого животного. Материал для электронно-микроскопического исследования был взят у 3 крыс и обработан по стандартной методике. 3Н-уридин (удельная радиоактивность 28 Ки/мМ) вводили внутрибрюшинно в дозе 160 МБк/г 5 крысам за один час до фиксации материала. Интенсивность включения изотопа оценивали по числу зерен восстановленного серебра на единицу площади объекта (100 μ2) в десяти полях зрения с учетом фона вне среза.
Результаты. Изучение цитологических характеристик нейронов Med в препаратах, окрашенных на нуклеиновые кислоты по Эйнарсону, и подсчет количества «темных» и «светлых» клеток на стадии диэструс показал, что на долю «светлых» клеток приходится 48-52 %.
Опираясь на особенности ультраструктуры нейронов, отражающих их функциональную активность, мы пришли к выводу, что состояние определенной части нейронов Меd (примерно 23%) может быть определено как состояние «умеренной активности». Оно характеризуется появлением в ядрах признаков транскрипционной активности: перихроматиновых фибрилл, очаговых скоплений перихроматиновых и интерхроматиновых гранул. Ядрышко обогащено гранулярным компонентом, но размеры его увеличены незначительно. Ядерные мембраны гладкие, не имеют инвагинаций и выбуханий. На наружной ядерной мембране определяется большее число рибосом. При этом ядро остается светлым, в то время как цитоплазма за счет увеличения числа канальцев гранулярной цитоплазматической сети, нарастания числа прикрепленных и свободных рибосом, полисом, гипертрофии темных митохондрий, становится умеренно электронно-плотной. Это проявляется осмиофилией цитоплазмы, которая становится темной на фоне светлого нейропиля и светлого ядра клетки.
Ультраструктура такой же части нейронов Меd (23%) на стадии диэструс отражает состояние «повышенной функциональной активности». Оно характеризуется содержанием больших количеств гранулярного материала в кариоплазме и ядрышке, при этом последнее увеличивается в размерах. Можно видеть явления рассеивания с поверхности ядрышка осмиофильного гранулярного материала. При этом в некоторых нейронах скопления РНП-частиц формируют компактные скопления недалеко от ядрышка, отделяясь от него небольшим щелевидным пространством. При этом ядрышко со скоплением РНП-частиц формирует фигуру наподобие увеличенной в размере «нативной» рибосомы. В участках рыхлого расположения интерхроматиновых гранул могут выявляться и перихроматиновые фибриллы. Перинуклеарное пространство расширяется, число и размеры ядерных пор увеличиваются. На поверхности ядра формируются многочисленные складки. Наблюдается очаговое расширение канальцев цитоплазматической сети, которые преобразуются в цистерны. Число прикрепленных рибосом на поверхности их мембран уменьшается, а число свободных рибосом и полисом возрастает. Увеличивается число гипертрофированных темных митохондрий во всех зонах клетки. Заметна гипертрофия комплекса Гольджи. Секреторные гранулы находятся около комплекса Гольджи или около плазматической мембраны в наружных зонах клетки. Цитоплазма этих нейронов выглядит более осмиофильной по сравнению с ядром клетки и окружающим ее нейропилем.
«Темные» клетки», количество которых составляет на стадии диэструс около 26%, выглядят электронноплотными. Это обусловлено наличием в ядре больших количеств гранулярногого материала, осмиофильной пылевидной субстанции, участков гетерохроматина. Ядрышко в таких клетках может быть рыхлым, увеличенным в размере с хорошо различимым гранулярным и фибриллярным компонентом, либо уменьшенным в размере, плотным, компактным. Возможно среди нейронов, находящихся на этой стадии могут быть выделены разновидности, что требует их дальнейшего изучения. В перикарионе «темных» клеток обращают на себя внимание резко расширенные цистерны цитоплазматической сети, между которыми лежат скопления полисом и свободных рибосом. Комплекс Гольджи достигает высокого уровня развития, локализуется в перинуклеарной зоне, около него определяется формирование секреторных везикул. Много гипертрофированных митохондрий, среди которых могут быть и светлые. Высокая осмиофилия цитоплазмы экранирует лизосомы и элементарные нейросекреторные гранулы, которые в небольшом количестве лежат в различных зонах цитоплазмы.
На стадии диэструса 23% нейронов имеют функциональное состояние, которое можно условно обозначить как стадию «покоя». Для них было характерно наличие светлого, богатого эухроматином клеточного ядра с расположенным в центральных зонах компактным ядрышком, небольших скоплений гетерохроматина. В цитоплазме представлены узкие канальцы гранулярной цитоплазматической сети, умеренное количество темных митохондрий, комплекс Гольджи, первичные лизосомы, небольшие скопления полисом и отдельные элементарные нейросекреторные гранулы, диаметр которых варьировал от 50 до 200 нм.
В автографах Med белых крыс, которым был введен 3Н-уридин, зерна восстановленного серебра обнаруживали преимущественно в ядрах нейронов и реже (иногда) - в цитоплазме. Подсчет зерен серебра на единицу площади объекта с учетом фона вне среза показал, что у крыс на стадии диэструс он равен 8,62 + 0,13. Сравнение вариационных рядов групповых средних, отражающих интенсивность включения изотопа на стадиях диэструс, эструс и метэструс показало, что выявившиеся различия являются статистически незначимыми.
Обсуждение. Наличие рецепторов к половым стероидам в нейронах Med предопределяет изменение их функциональной активности в ответ на колебания уровней этих гормонов, имеющее место в эстральном цикле.
Изучение нейронов Med в препаратах, окрашенных на нуклеиновые кислоты по Эйнарсону, и подсчет количества «темных» и «светлых» клеток на стадии эструса, метэструса [1] и диэструса показали, что при смене стадий эстрального цикла изменяется их соотношение. Так на стадии диэструс доля светлых клеток составляет 48-52%, эструс - 60-62%, метэструс 38-42%. Электронно-микроскопический анализ нейронов Меd в целом подтвердил данные, полученные с помощью светового микроскопа, хотя часть клеток воспринимаемых на светооптическом уровне как «темные» или «светлые» отошла в разряд переходных. Можно полагать, что нейроны Med под влиянием гормональных факторов способны возвращаться в некое исходное состояние, для того чтобы вновь его изменить в следующую фазу эстрального цикла, т.е. имеет место явление реверсии, широко представленное среди нейросекреторных клеток [3].
Часть нейронов Med, по-видимому, или не реагируют на колебания уровней половых стероидов (вследствие временной десенсибилизации к действию гормонов), или реагируют асинхронно. Предполагать последнее позволяют сведения о гетерогенности эстрогенных рецепторов, в составе которых выделено два подтипа: эстрогенные рецепторы a-типа и b-типа [12]. Показано, что их биологическое значение существенно различается: если рецепторы субтипа a способны, формируя гормон-рецепторные комплексы, оказывать активизирующее действие на транскрипционные процессы в клетке, то субтипа b - ингибирующее [4,11].
Приведенные выше характеристики «темных» и «светлых» клеток, показывающие наличие различий в их состоянии могут быть объяснены на основании механизма действия половых стероидов на геном клетки [6]. Известно, что эти гормоны легко проникают в клетку и связываются со специфическими рецепторами в цитоплазме, формируя гормон-рецепторные комплексы. Ядерная транслокация гормон-рецепторных комплексов вызывает активацию генома вследствие их взаимодействия с акцепторными местами хроматина. Можно предполагать и изменение состояния ядерного матрикса, зная что биосинтез РНК происходит в непосредственной связи с ним [10], а также реальность амплификации рДНК, позволяющей объяснить быстрое нарастание числа рибосом в метэструсе [2]. Все это обеспечивает интенсивный синтез белка в клетке, идущего на создание необходимого пула цитозольных рецепторов, представляющих собой гидрофильные белки, а также других веществ, обладающих свойствами секретов - аргинин-вазопрессина, энкефалина, субстанции Р, катехоламинов [7,8,11,13].
Можно полагать, что в стадию эструс под влиянием пиковых концентраций эстрадиола и лютеинизирующего гормона происходят начальные процессы активизации генов [9], экспрессия которых проявляется в стадию метэструса повышением активности белоксинтезирующего аппарата клетки. На стадии диэструс, когда концентрация эстрогенов в сыворотке крови находится на низком уровне, активность трансляционных процессов стихает и нейроны «входят» в состояние «покоя».
Полученные нами результаты по авторадиографии показали, что интенсивность включения 3Н-уридина в нейроны Меd на стадии диэструс была больше по сравнению со стадией метэструс и меньше, чем на стадии эструс. Выявившиеся различия оказались статистически не достоверными.
Авторы приносят свою благодарность зав. кафедрой гистологии Военно-медицинской Академии проф., д.б.н. Р.К.Данилову за помощь в проведении авторадиографических исследований.
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Ахмадееев А.В., Калимуллина Л.Б. //Цитология. - 2005. - Т. 46, - № 5. С.45
- Бельков В.В. //Генетика. - 1982. - Т.18. - № 4. С. 529.
- Гарлов П.Е. //Цитология. - 2002. - Т. 44. - №8. - С. 747.
- Ишунина Т.А., Должиков А.А., Гриневич В.В. //Успехи физиол. наук. - 2001. - Т. 3. - №21. - С.48.
- Калимуллина Л.Б. и др. //Цитология. - 2000. - Т. 42. №4. - С. 343.
- Розен В.Б. В кн.: Физиология гормональной рецепции. - 1986. - Л. Наука. - С.5.
- Чепурнов С. А., Чепурнова Н.Е. Нейропептиды и миндалина. - М.: Изд-во МГУ. - 1985. - 128с.
- Asmus S., Neuman S.//J. Neurobiol. 1994.V.25. P.156.
- Fannon S.A., Vidaver R.M., Marts S.A. //J. Appl. Phys: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 2001.V.91. P.854.
- Jackson D.A., Cook P.R. //EMBO J. 1985.V.4. P.919.
- Isgor C.et al. //Brain Res.Mol. Brain Res. 2002. V.106. P.30.
- Kuiper G.G.J.M. et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P.5925.
- Plumari L. et al. //J.of Neuroendocr. 2002.V.14.P. 971.