Материалы и методы. Материалом для исследования служили суспензии клещей ( нимфы, имаго) голодных и напитавшихся, суспензии органов экспериментально зараженных белых мышей, сыворотки крови КРС и МРС. От больных поступали кровь, сыворотка, плазма крови, ЦСЖ с диагнозами: лихорадка неясной этиологии, КЭ, КМЭ, менингит, энцефалит, менингоэнцефалит, энцефаломиелит, миеломная болезнь, серозный менингит, энцефалопатия, лимфоцитома, ХАД, заболевания опорнодвигательной системы и другие.
Методом выбора при диагностике иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ) является НРИФ. Для постановки реакции использовали корпускулярный антиген Ip-21 B.afzelii и ФИТЦ - меченные коньюгаты поливалентные, против IgM и IgG человека производства НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи. Антитела к боррелиям выявляли в титрах 1:40-1:640. НРИФ также ставили с целью обнаружения боррелиозного антигена в ЦСЖ. Мазки обрабатывали антиборрелиозной сывороткой, на другой мазок наносили гомологичную сыворотку этого же больного с титром антител 1:160 - 1:320, на третий - отрицательную сыворотку. При постановке ИФА использовали диагностическую тест-систему (ООО «ОМНИКС», Санкт-Петербург) для обнаружения иммуноглобулинов класса М и класса G к Borrelia burgdorferi s.1. ПЦР ставили с набором реагентов «Ампли-Лайм» ( ООО «ОМНИКС») для обнаружения хромосомной ДНК патогенных геновидов боррелий (Borrelia burgdorferi ss, B.afzelii, B.garinii, B.valaisiana, B.lusitaniae) размер специфического ампликона 500 н.п. В ПЦР используется внутренний контроль, представляющий собой плазмиду со встроенным участком ДНК размером 800 н.п. Детекцию продуктов амплификации проводили в агарозном геле 1,7%. Для выявления инфицирования вирусом КЭ и установления диагноза клещевого энцефалита повсеместно используются лабораторные методы иммуноферментного анализа антигенов ВКЭ и антител к ним в сыворотках крови пациентов. Анализ антигена ВКЭ используется для определения инфицированности клещей, снятых с людей или с КРС и МРС. ИФА предназначен и для выявления ВКЭ в ликворе человека или животных и используется в клинических и эпидемиологических исследованиях, а так же для выявления IgM к ВКЭ и IgG к ВКЭ ( ЗАО «Вектор-Бест»). Данные тест-системы выпускаются в соответствии с требованиями ВФС 42-3503-99 и её производство сертифицировано как медицинского иммунобиологического препарата (1).
Работами авторов (6,9) показаны преимущества анализа РНК ВКЭ перед анализом антигенного вируса иммуноферментным методом. Авторы считают, что возможны расхождения результатов ПЦР и ИФА, причина объясняется маскировкой вируса за счет формирования иммунных комплексов. ЗАО «Вектор-Вест» поставляет тест - систему анализа в его наиболее высокочувствительном варианте, основанном на методе обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Для увеличения чувствительности анализа этап ПЦР проводили в «nested» - варианте: первый раунд - с «внешней» парой олигонуклеотидов - праймеров, второй раунд - с «внутренней» парой олигонуклеотидов - праймеров и аликвотой реакционной смеси ПЦР первого раунда в соответствии с наставлением. Размер специфического ампликона в первом раунде ПЦР с «внешними» праймерами - 340 пар оснований, во втором раунде ПЦР с «внутренними» праймерами - 171 пара основаниями. Детекцию результатов ПЦР- анализа проводили визуально после гель-электрофореза в агарозе. В наших исследованиях не всегда результаты ПЦР совпадали с результатами ИФА. Несовпадение результатов возможно объяснить инфицированием людей т.н. дефектными вариантами вирусов. Лица, инфицированные антигенно - дефектными штаммами, в клинических условиях образуют группу т.н. серонегативных больных и больных с низкими титрами антител (4).
Результаты и обсуждение. Анализ результатов клинико-эпидемиологического обследования позволил установить, что на территории Краснодарского края и Р.Адыгея встречаются разнообразные нозологические формы ИКБ и включают все основные, характерные для этой инфекции синдромы: общеинфекционный, поражения кожи, нервной, сердечно-сосудистой системы и опорно-двигательного аппарата (4,5).
Следует отметить, что курируемая территория не входит в перечень регионов по распространению КЭ. Однако данные, полученные в нашей лаборатории, позволяют говорить о расширяющемся ареале распространения иксодовых клещей, носителей ВКЭ, и, по-видимому, о расширении территории заболеваемости клещевым энцефалитом. Комплексное исследование полевого материала на зараженность возбудителями природноочаговых инфекций позволило установить, что в суспензии клещей обнаруживается ДНК боррелий методом ПЦР и в этих же пробах выявили антиген вируса КЭ. Таким образом, на территории края циркулируют возбудители ИКБ и КЭ, что может привести к развитию микст-инфекции у людей. Следует отметить, что еще в 1989 - 2000гг. антиген ВКЭ был обнаружен у диких млекопитающих в 24 случаях, у клещей - 37 пробах. Антитела к ВКЭ обнаружили в трех сыворотках с/х животных и в тридцати сыворотках людей. В 2004 году антитела к ВКЭ обнаружены в пяти сыворотках людей с диагнозом ЛНЭ (лихорадка неясной этиологии).
По данным различных авторов (2,7,8,10) частота возникновения микст-инфекций (МИ) ИКБ и КЭ в разных регионах страны колеблется в широких пределах - до 4,8 %.
Нами в 2004 году подтверждена МИ (ИКБ+ КЭ) у больного из Вологды, где произошел укус клеща, а так же в 2005 году у больной г.Краснодара. Следует отметить, что положительные результаты были получены в НРИФ, ПЦР, а ИФА результаты были отрицательные. Определение вирусной РНК в плазме крови больной и ЦСЖ и отрицательный результат ИФА вероятно указывает на серонегативную форму болезни КЭ. Положительные результаты на ИКБ получены у этой больной методом ПЦР и НРИФ. Антитела к боррелиям выявлены в титре
1: 320. В НРИФ при поиске антигена в ЦСЖ наблюдали специфическое свечение клеток боррелий как с положительной антиборрелиозной сывороткой, так и с гомологичной плазмой больной. Клиническое распознавание ИКБ и КЭ на первом этапе основывается на известных клинико-эпидемиологических данных. При КЭ в анамнезе также выявляется укус клещей или употребление сырого инфицированного молока коров или коз. А клинические исследования выявляют нейроинфекционный характер болезни. При МИ (ИКБ+ КЭ) прослеживаются три основных синдрома: общий инфекционный, менингеальный и очаговое поражение нервной системы.
Заключение. Опыт работы последних лет указывает на необходимость проведения исследований по клещевым инфекциям на территории края по совершенствованию эпизотолого - эпидемиологического надзора, оснащения лабораторий современными диагностическими тест-системами, совершенствования методов профилактики и проведения акарицидных обработок. Проведение этих мероприятий невозможно без поддержки централизованных и местных бюджетных средств. Очень актуальным является решение вопроса о комплексной серологической диагностике, позволяющей обнаруживать антитела и антигены к различным возбудителям клещевых инфекций, особенно МИ, и своевременном назначении сочетанной противовирусной терапии с антибиотиками в остром периоде болезни. В целях улучшения качества диагностической помощи, её унификации, совершенствования необходимо разработать и внедрять единую информационную систему слежения с помощью компьютерной обработки специальных тематических карт, заполняемых лечащими врачами на каждого больного (11).
С целью прогнозирования заболеваемости клещевыми инфекциями необходимо динамичное слежение за распространением клещей, их вирусофорностью, определения зон прокормителей клещей, территории риска. Следует проводить работу с населением через СМИ. Необходимо уделять особое внимание совершенствованию уровня подготовки врачей и средних медицинских работников по диагностике, лечению и реабилитации больных ИКБ, КЭ и других клещевых инфекций.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Амосов А.Д. // Клещевой энцефалит. Кольцово 2002. - 112с.
- Бочкова Н.Г., Левина Н.С.// Новое в диагностике клещевого энцефалита. Научн.конф. «Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами». - Иркутск 1996.- с55-56.
- Гальцева Г.В., Юничева Ю.В., Костюковский В.М. и др. // Перспективы диагностики клещевого боррелиоза. Актуал.аспекты природно-очаговых инфекций.- Омск, 2001.- с.119-120.
- Гальцева Г.В.,Юничева Ю.В., Малай В.И. и др. // Некоторые аспекты клещевого боррелиоза в Краснодарском крае. «Клещевые боррелиозы». - Ижевск, 2002.- с.100-102.
- Гальцева Г.В., Юничева Ю.В.,Стержантова Л.В. и др. // Иксодовые клещевые боррелиозы - болезнь Лайма: Матер.конф. ПЧУ России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны. - Москва, 2004. - с.153-156.
- Злобин В.И., Цветкова Э.А., Наволодкин О.А. и др. // Сравнение трех экспресс-методов индикации вируса клещевого энцефалита. Вопросы вирусологии, 1990. 1. с .57-59.
- Коренберг Э.И.// Клещевой энцефалит. Природная очаговость болезней. Исследование института Гамалеи РАМН, Москва, 2003.- с.35-63.
- Попонникова Т.В., Субботин А.В.// Исходы менингоэнцефалита при сочетанной инфекции ИКБ и КЭ у детей. «Клещевые боррелиозы». - Ижевск, 2002.- с.234-237.
- Пищенко Н.Д., Кветкова Е.А., Шаманин Е.А. и др.// Применение метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот для диагностики клещевого энцефалита. «Клещевой энцефалит». Тр.института им.Пастера. Том 65. Ленинград 1989. - с.169-175.
- Осинцева Т.С.// Неврологические аспекты микст-инфекции ИКБ и КЭ в резидуальном периоде.: мат.н/п.конф. «Клещевые боррелиозы». - Ижевск, 2002. - с.222-224.
- Щадрин С.Г., Забродин Н.А., Ромаданова Т.В. и др.// Эпидемиологическая ситуация и клиническая характеристика клещевого боррелиоза в Удмуртии. Там же с.301-307.