Научный журнал

Успехи современного естествознания

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

• Авторы
• Резюме
• Файлы

Сердюк Л.В. Попкова С.М. Лещук С.И. Немченко У.М. Кичигина Е.Л.

Разработанный способ исследования копрологических проб на наличие антител к бифидофлоре с использованием оригинальных эритроцитарных тест-систем для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) позволяет оценивать иммунореактивность макроорганизма к симбионтной микрофлоре, не прибегая к инвазивным методам отбора диагностического материала. Популяционный уровень антител в копропробах отражает состояние системного иммунитета (по уровню антител в сыворотках крови) и согласуется с архитектоникой видов бифидобактерий в исследуемой популяции. Выявление антител к бифидобактериям, в комплексе с бактериологическим исследованием копрологического материала позволяет дать более полную оценку микроэкологического статуса организма. Коррекция дисбиотических нарушений у детей должна проводиться на основании результатов бактериологического обследования, дающего информацию о количественном и качественном состоянии микробиоты, с учётом функционального состояния локального иммунитета, в норме толерантного к симбионтной интестинальной бифидофлоре.

Статья в формате PDF

373 KB

Слизистые оболочки пищеварительного, дыхательного и мочеполового трактов являются естественными путями проникновения и колонизации для многих патогенных микроорганизмов. Защита этих оболочек обеспечивается иммунокомпетентными клетками, организованными в специальные лимфоидные ткани. Эта, так называемая, мукозная иммунная система является первым барьером на пути инфекций в отличие от системной иммунной системы, обеспечивающей защиту внутренних органов организма. [13]. Филогенетически иммунная система кишечника наиболее древняя, и, как предполагают, ее развитие, предшествовало большинству других лимфоидных структур, в том числе тимуса [16]. Около 70% всех лимфоцитов организма сосредоточены в слизистой оболочке кишечника, вырабатывая IgA. Кишечный иммунитет сбалансирован между способностью к защитной иммунной реакции по отношению к патогенным микроорганизмам и способностью оставаться толерантным по отношению к огромной нагрузке антигенов, представляемых комменсальными интестинальными микроорганизмами [15].

Нормальная микрофлора кишечника играет важную роль в жизнедеятельности организма. Доказано её благотворное воздействие на физиологию кишечника и организм в целом, что обусловлено защитными, структурными и метаболическими эффектами. Взаимодействие между энтероцитами и микроорганизмами индигенной микрофлоры приводят к формированию на поверхности интестинальных слизистых оболочек защитного биослоя, препятствующего колонизации, адгезии, инвазии и пенетрации патогенных и условно-патогенных микроорганизмов [3]. Одновременно с этим кишечная микрофлора оказывает постоянное стимулирующее воздействие низкой степени на иммунную систему кишечника, что крайне важно для нормального функционирования иммунитета и формирования иммунной толерантности к антигенам индигенной микрофлоры [9, 2]. Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) макроорганизма - это открытая биологическая система, которая находится в постоянном контакте с микромиром. Основной принцип действия протективных механизмов, осуществляющих контроль за колонизацией ЖКТ, состоит в способности отличать непатогенные элементы (бактерии-симбионты, пища) от энтеропатогенов. Качественные (видовые) и количественные соотношения между разными группами микроорганизмов характеризуются определенной стабильностью, что важно для реализации разнообразных функций нормальной микрофлоры, таких как поддержание колонизационной резистентности, участие в процессах пищеварения, синтеза витаминов и бактериоцинов. В лимфоидной ткани, принимающей участие в формировании периферической толерантности к интестинальной микрофлоре, происходит синтез иммуногло6улинов, проявление клеточной цитотоксичности Т-киллерами, продукция цитокинов Т-лимфоцитами, макрофагами и NК-клетками (естественными киллерами) [12]. Утрата «орaльной» толерантности к симбионтной микрофлоре, может привести к выработке специфических иммуноглобулинов, выделение и идентификация которых возможны как из сывороток крови, так и копрологических проб.

Цель работы: показать возможность оценки уровня иммунореактивности организма к индигенной микрофлоре по наличию антител, выявляемых с помощью оригинальных тест- систем методом РНГА в копрофильтратах человека; провести сравнение результатов исследования копрофильтратов с исследованиями сывороток крови.

Материалы и методы исследования

Объектами исследования являлись копрологические пробы пациентов гастроэнтерологического центра при Научном центре проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН (ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ СО РАМН») с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта, проживающих в г. Иркутске. Образцы сывороток крови взяты у аналогичного контингента пациентов. Всего исследовано около 200 копрологических проб и столько же сывороток. Постановка реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации для определения специфических антител производилась с помощью оригинальных тест-систем, изготовленных на основе фракций клеточных стенок трех видов бифидобактерий (Bifidobacterium bifidum, B. longum и B. adolescentis) [4, 6]. Для контроля тест-систем использовали специфическую иммунную кроличью сыворотку с титром антител к бифидобактериям не менее 1:64. При обработке материала учитывали условно низкие титры антител, определяемые в разведениях от 1:2 до 1:32, и условно высокие титры - от 1: 64 и выше.

Статистическую обработку данных проводили с использованием программ «Excel» и «Statgrafics». Различия считали достоверными при P ≤ 0,05.

На основе описанных в литературе способов подготовки копрофильтратов для исследования методом ИФА [1, 13] нами был адаптирован свой метод получения копрофильтратов для исследования в РНГА на наличие антител к бифидофлоре (наиболее многочисленной в составе микробиоценоза кишечника). С этой целью отбирали свежие копропробы. Навески исследуемого материала производили на электронных весах, помещая в пластиковые пробирки не более 1 г, приливали к нему 0,9% физиологический раствор в соотношении 1:2, тщательно растирали стеклянной палочкой и центрифугировали при 7000 об/мин. в течение 15 минут. Надосадочную жидкость (копрофильтрат) при помощи пипетки перемещали в чистые пробирки. На поверхность копрофильтрата наслаивали взвесь отмытых формалинизированных эритроцитов и оставляли при комнатной температуре до полного их осаждения, после этого копрофильтрат центрифугировали при 2500-3000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость титровали в иммунологических планшетах в 8 и более лунках, добавляли в каждую лунку по 25 мкл специфического антигенного диагностикума. Через 20-24 часа визуально определяли титры антител по наличию агглютинации: выпадение эритроцитов в виде точки свидетельствовало об отсутствии агглютинации, при положительной реакции (наличии антител) эритроциты выпадали на дне лунки равным слоем, т.е. в виде зонтика. Все манипуляции осуществлялись при комнатной температуре.

После отработки методики и проведения РНГА на наличие антител к бифидобактериям в копрофильтратах с помощью оригинальных тест-систем было установлено:

1. тест-системы качественно улавливали наличие антител в образцах;
2. результаты сочетались с нашими предыдущими исследованиями по определению антител в крови и данными по распространенности разных видов бифидобактерий среди детского населения региона, выполненными с помощью молекулярно-генетических исследований (ПЦР) [7, 8].

Проведенные ранее исследования по изучению популяционной иммунореактивности к бифидофлоре у здоровых лиц г. Иркутска (образцы сывороток крови) показали, что основная часть выборки ( > 80%) не имела антител к бифидобактериям или имела их в очень низкой концентрации. Лишь у 10% лиц определялись антитела к бифидобактериям в высоких титрах. Такой профиль распределения показателей концентрации антител практические соответствует нормальному эволюционно закрепленному вариационному ряду - распределению Пуассона. Следовательно, отсутствие антител и (или) наличие их в низкой концентрации для данной популяции можно считать нормой (рис. 1).

Результаты исследования копрофильтратов и образцов сывороток пациентов гастроэнтерологического отделения, что наименьший процент выявления высоких титров мукозных и сывороточных антител в выборке (200 обр.) по г. Иркутску был к виду B.longum, а наибольший - к B. bifidum (рис. 2).

Однако в среднем титры сывороточных антител незначительно выше, чем мукозных. Полагаем, что это можно объяснить бóльшим суммарным количеством агглютинирующих иммуноглобулинов, циркулирующих в крови (в основном классов G и M) по сравнению с ЖКТ, где преобладают иммуноглобулины класса А.

При исследовании копрофильтратов частота выявленния высоких титров мукозных антител среди детей до года составила: к B. bifidum - 15%, B. longum -1% и к B. adolescentis - 3%. У детей от 1 года до 6 лет частота выявления высоких титров мукозных антител к B. bifidum составила 21%, B.longum - 4% и к B.adolescentis - 4%. У детей от 7 до 17 лет по тем же показателям к B. bifidum - 2%, B. longum и B. adolescentis - 0%. У лиц старше 18 лет наличие высоких титров мукозных антител к B. bifidum определялось у 10%, к B. longum и B. adolescentis антитела не регистрировались.

Таким образом, у детей от 1 года до 6 лет при исследовании копрофильтратов в РНГА определена наибольшая реактивность к бифидофлоре, в остальных возрастных группах уровень иммунореактивности либо в норме, либо близок к ней.

Анализ копрологических проб с целью выявления антител к: энтеробактериям, HbsAg и ВИЧ проводился ранее другими исследователями с помощью достаточно дорогих тест-систем методом ИФА [1, 13]. Нами разработан способ анализа копрофильтратов на содержание антител к бифидобактериям методом РНГА, с использованием оригинальных и недорогих в изготовлении эритроцитарных диагностических тест-систем. Предлагаемый нами способ позволяет определять как наличие, так и концентрацию противобактериальных антител в копрофильтратах человека. Особо следует отметить неинвазивность способа получения материала для исследования. Наибольшая реактивность интестинального иммунитета к бифидофлоре отмечена у детей от года до 6 лет, в остальных возрастных группах иммунореактивность проявлялась редко. Эти факты требуют дальнейших исследований и осмысления. Возможно, повышенная реактивность к антигенам бифидобактерий у детей раннего возраста может быть в какой-то степени обусловлена активной в последние годы практикой внедрения в организм эндогенных штаммов пробиотических микроорганизмов, используемых в препаратах и продуктах функционального питания (Бифидумбактерин, Бифидок и пр.) для коррекции дисбиозов. Видовая идентификация антител к бифидобактериям позволит получать объективную информацию о степени микроэкологического дисбаланса и, следовательно, определять более адекватные методы коррекции дисбиозов, способствующие формированию нормальной микрофлоры.

1. Патент № 2338197 РФ. Способ диагностики выраженности дисбактериоза кишечника / Алешукина А.В.; опубл. 2006.
2. Ипатова М.Г., Шумилов П.В., Мухина Ю.Г. и др. Дисрегуляция иммунного ответа на индигенную микрофлору у детей и подростков с воспалительными заболеваниями кишечника// Педиатрия. - 2010. - Т.89, №2. - С. 45-49.
3. Копанев Ю.А. Значение кишечной микрофлоры для здоровья человека. Роль пробиотиков и пребиотиков для коррекции и профилактики нарушений микробиоценоза // Трудный пациент. - 2008. - №11. - С. 39-43.
4. Патент № 2202801 РФ. Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума / С.И. Лещук, С.М. Попкова, Л.В. Сердюк и др.; опубл. 2007.
5. Патент № 2142807 РФ Способ приготовления эритроцитарного иммунодиагностикума и способ оценки иммунорезистентности организма / С.И. Лещук, С.М. Попкова, Л.В. Сердюк [и др]; опубл. 1999.
6. Попкова С.М., Лещук С.И., Анненков В.В. и др. Сравнительная характеристика эритроцитарных иммунодиагностикумов по определению нормальных бактериальных антител // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2007. - №3. - С. 43-48.
7. Попкова С.М., Шмелёва Е.А., Злобин В.И. Популяционный уровень иммунореактивности макроорганизма к антигенам микрофлоры человека (на примере взаимоотношений с антигенами C.diphtheriae и Bifidobacterium) // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2003. - №1. - С.164-169.
8. Ракова Е.Б., Попкова С.М., Джиоев Ю.П. и др. Видовая архитектоника и плазмидный профиль бифидобактерий кишечной микробиоты у населения Иркутской области // Вестник Российской военно-медицинской Академии. - 2008. - №2 (22), Ч.II. - С. 660-661.
9. Хавкин А.И. Микробиоценоз кишечника и иммунитет // Русский медицинский журнал. - 2003. - №11 (3). - С. 122-125.
10. Хаитов Р.М. Физиология иммунной системы. - М.: ВИНИТИ РАН, 2001. - С. 223.
11. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Иммунная система ЖКТ: особенности строения и функционирования в норме и патологии // Иммунология. - 1997. - №5. - С. 4-7.
12. Хромова С.С., Ефимов, Б.А., Тарабрина Н.П. и др. Иммунорегуляция в системе микрофлора - интестинальный тракт // Аллергология и иммунология. - 2004. - Т.5, №2. - С. 265-271.
13. Щелкунов С.Н., Саляев Р.К., Рекославская Н.И. и др. Изучение иммуногенных свойств кандидатной съедобной вакцины против вирусов гепатита В и иммунодефицита человека на основе плодов трансгенных растений томата // Доклады Академии наук. - 2005. - Т. 401, №5. - С. 709-711.
14. Мауеr L. Ога1 tolerance: new approaches, new problems // Сlin. Immunol. - 2000. - №94. - Р.1-8.
15. Mueller C., Macpherson A.J. Layers of mutualism with commensal bacteria protect us from intestinal inflamation //
    Gut. - 2006;55:276-284.doi: 10.1136/gut.2004.054098.
16. Pasquier Du.L, Flajnik M. Origin and evolution of the immune system // In: Paul WE, eds. Fundamental immunology, 4th edn. Philadelphia: Lippincott-Raven, 1999:605-99.

Библиографическая ссылка