Научный журнал

Успехи современного естествознания

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Николаев А.А. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Астраханский государственный медицинский университет Минздрава России»

Проведен анализ возможности образования комплексов Ингибина-А с одним из острофазовых белков – лактоферрином. Методами электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноэлектрофореза показано образование комплексов ингибин-А-лактоферрин на основании изменения электрофоретической подвижности ЛФ и ингибина-А. Предполагается, что фракции с большей электрофоретической подвижностью содержат преимущественно молекулы ингибина-А (имеющего больший отрицательный заряд), а в более медленной фракции преобладает положительный заряд лактоферрина. Обсуждаются возможные механизмы образования интерполимерных комплексов ингибин-А-лактоферрин.

Статья в формате PDF

2602 KB

ингибин-А

лактоферрин человека

интерполимерное взаимодействие

снижение овариального запаса

1. Гудинская Н.И., Николаев А.А., Способ получения и очистки ингибина-А человека / Патент России № 2 434 018, 2011.Бюлл. № 36.

2. Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. – М.: Мир. – 1976. – 368 с. 

3. Николаев А.А., Алтухов С.А., Аншакова Н.И. Образование интерполимерных комплексов белками семенной плазмы // Вопросы медицинской химии. – 1990. – № 4. – С. 234–238.

4. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. – М.: Наука, 2006.

5. Соколов А.В. Обнаружение и выделение из грудного молока комплекса церуллоплазмина и лактоферрина // Биохимия. – 2006. – Т.71., № 2. – С. 208-215.

6. García-Montoya I.A., Cendón T.S., Arévalo-Gallegos S., Rascón-Cruz Q. Lactoferrin a multiple bioactive protein: An overview// Biochimica et Biophysica Acta. – 2012. – v.1820 – p.226–236.

7. Miyauchi S., Umekita K., Hidaka T., Umeki K., Aratake Y., Takahashi N., Sawaguchi A., Nakatake A., Morinaga I., Morishita K, Okayama A Increased plasma lactoferrin levels in leucocytapheresis therapy in patients with rheumatoid arthritis // Rheumatology (Oxford). 2014. – V.53. – № 11. – Р. 1966–1972.

8. Nicks K.M., Fowler T.W., Akel N.S., Perrien D.S., Suva L.J., Gaddy D. The role of gonadal inhibins // Ann N Y Acad Sci. 2010 – v.1192. – № 3. – p. 133–160.

9. Pouresmaeili F., Fazeli Z. Premature Ovarian Failure: A Critical Condition in The Reproductive Potential with Various Genetic Causes // Int J Fertil Steril. – 2014. – v. 8-№ 1. – р. 1–12.

10. Skelte G. Anema А, C.G. (Kees) de Kruif Complex coacervates of lactotransferrin and b-lactoglobulin// Journal of Colloid and Interface Science V. – 2014. – v.430. – № 15. – P. 214–220.

Уменьшение овариального запаса может быть важным фактором, когда никакое другое очевидное объяснение происхождения бесплодия не найдено [9]. Установлено, что высокой точностью определения овариального резерва обладают методы, основанные на определении уровня различных пептидов, вырабатываемых в яичнике (ингибин-А и ингибин-В, активин-А, антимюллеровый гормон). Прикладные методы оценки овариального резерва, применяемые для установления риска развития бесплодия, не имеют до настоящего времени объяснения причин этого явления и роли в его патогенезе ингибинов, в частности, ингибина-А. .В настоящее время ряд исследователей [8.] пришли к выводу, что даже наличие достаточных уровней ингибина-А в крови не всегда гарант успеха при лечении бесплодия. Вероятно, это связано с наличием у пациентов биохимических факторов воспаления (цитокинов, острофазовых белков), вызывающих снижение биологической активности ингибина-А.

Известно [8], что ингибин-А и активин способны образовывать стабильные комплексы с некоторыми растворимыми белками, и эти комплексы снижают способность ингибина-А взаимодействовать с рецепторным аппаратом. Среди маркеров воспаления один из наиболее распространенных – лактоферрин [7], который обладает, многократно доказанной способностью к интерполимерным взаимодействиям [3, 10].

Целью нашей работы стало выявление возможности образования комплексов Ингибина-А с одним из острофазовых белков – лактоферрином.

Материалы и методы исследования

В работе использовали препарат ЛФ, полученный в нашей лаборатории и полученный нами по описанному ранее способу ингибин-А[1 ]. Для выяснения возможности образования межмолекулярных комплексов ингибина-А и ЛФ использованы применявшиеся для изучения межмолекулярных взаимодействий, методы электрофореза, гель-фильтрации [4], иммуноэлектрофореза и иммунодиффузионного анализа в агаре (ИДА) [2].

Были приготовлены маточные растворы ЛФ и ингибина-А на 0,85 % растворе хлорида натрия с концентрацией 1,0 мг/мл.

Далее было приготовлено два ряда смесей, как указано в табл. 1.

таблица 1

Разведения ингибина-А и ЛФ

Результаты исследования и их обсуждение

Все образцы были подвергнуты электрофорезу в полиакриламидном геле и, как видно на рис. 1, отмечено изменение электрофоретической подвижности ЛФ и ингибина-А по сравнению с чистыми препаратами этих белков, а также появление дополнительных фракций. Разведения ЛФ на ингибине-А и разведения ингибина-А на ЛФ охватывают молярное соотношение ингибина-А к ЛФ от 1:6 до 65:1. При малых концентрациях ингибина-А относительно ЛФ (№ 1-5, 1-4, 1-3) характерная полоса ингибина-А, имеющего высокую катодную подвижность, вообще не наблюдается, а отмечается мощная фракция ЛФ, электрофоретическая подвижность которой практически не отличается от электрофоретической подвижности контрольного препарата ЛФ. при низких концентрациях ЛФ (№ 2-5; 2-4), отмечается наличие фракций ЛФ и ингибина-А, практически идентичных по электрофоретической подвижности контрольным препаратам. Более наглядные результаты наблюдаются (рис 1.) при электрофорезе разведений № 2-3 и № 2-2.

Рис. 1. Электрофорез в полиакриламидном геле: 1 – препарат ЛФ; 2 – препарат ингибина-А; 3 – смесь ингибина-А и ЛФ № 2-3; 4 – сыворотка крови человека. Окраска Coomasi blue

При выбранном в этих разведениях молярном соотношении ингибин-А – ЛФ (14/1 и 7/1 соответственно), визуально наиболее ярко проявляется изменение электрофоретической подвижности ЛФ и появление гетерогенности в области зоны его миграции от 2 до 4 фракций. На следующем этапе мы исследовали возможность образования комплекса ингибин-А – ЛФ методом иммуноэлектрофореза.

Этот метод оказался более информативным и менее трудоемким в оценке возможности образования межмолекулярных комплексов т.к. позволяет не только оценить сам факт образования комплекса в результате изменения электрофоретической подвижности, но и предоставляет значительно больше возможностей в количественной оценке данного феномена. На рис. 2. хорошо видно изменение электрофоретической подвижности как ингибина-А, так и ЛФ, находящихся в смеси друг с другом, в данном случае, в молярном соотношении ЛФ/ингибин-А примерно 1/14.

Рис. 2. Иммуноэлектрофорез препаратов ЛФ и ингибина-А: 1 – препарат ЛФ; 2 – препарат ингибина-А; 3 – смесь ингибина-А и ЛФ № 2-3; А – антисыворотка к белкам сыворотки крови человека; Б – антисыворотка к ЛФ; В – антисыворотка к ингибину-А

Количественная оценка результатов иммуноэлектрофореза смесей ЛФ – ингибин-А подтвердила вероятность образования межмолекулярных комплексов этих белков.

Как показано в табл. 2, электрофоретическая подвижность препарата ингибина-А относительно альбумина человека составляет 1,08±0,004; электрофоретическая подвижность препарата ЛФ относительно альбумина человека составляет 0,48±0,006. В смеси ингибина-А и ЛФ № 2-3, относительная электрофоретическая подвижность фракции выявляемой антисывороткой к ингибину-А составляет 0,6±0,005, а относительная электрофоретическая подвижность фракции, выявляемой антисывороткой к ЛФ, составляет 0,58±0,004. Эти различия электрофоретической подвижности чистых препаратов ЛФ и ингибина-А и их смеси статистически достоверны (Р<0,001)..

в смеси ингибина-А и ЛФ № 2-2, относительная электрофоретическая подвижность фракции, выявляемой антисывороткой к ингибину-А, составляет 0,61±0,005, а относительная электрофоретическая подвижность фракции, выявляемой антисывороткой к ЛФ, составляет 0,57±0,007, и выявленные различия также достоверны (Р<0,001).

Эти данные подтверждают и полученные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле результаты о гетерогенности образующихся комплексов ингибин-А – ЛФ. Как видно из табл. 2, в смеси ЛФ и ингибина-А как в № 2-3 так и в № 2-2, антисыворотки к этим белкам выявляют различные фракции комплексов ингибин-А – ЛФ, обладающие различной электрофоретической подвижностью.

В табл. 2. литерой Р1 обозначены достоверности различий относительной электрофоретической подвижности фракций, выявляемых антисыворотками к ингибину-А и лактоферрину, находящихся в межмолекулярных комплексах.

Таблица 2

Относительная электрофоретическая подвижность(ОЭП) ингибина-А и ЛФ в чистых препаратах и их смесях (объяснения в тексте)

Статистический анализ показал, что эти различия значимы, и для смеси № 2-3 составляют Р1<0,02, а для смеси № 2-2 составляют Р1<0,005. можно предположить, что фракции с большей электрофоретической подвижностью содержат преимущественно молекулы ингибина-А (имеющего больший отрицательный заряд), а в более медленной фракции преобладает положительный заряд ЛФ. Выявление различных фракций комплекса ингибин-А – ЛФ с помощью различных антисывороток, позволяет предположить, что образование этих комплексов происходит, как минимум, двумя путями. Во-первых, в исследованных смесях наблюдается более чем 10-кратное преобладание ингибина-А над ЛФ в молярном соотношении, и наиболее вероятный механизм образования комплекса – это электростатическое взаимодействие нескольких молекул ингибина-А, несущих достаточно высокий отрицательный заряд, с поликатионом ЛФ. При этом взаимодействии, тем или иным образом, экранируются антигенные детерминанты ЛФ, и быстрая фракция комплекса не выявляется антисывороткой к ЛФ. Во-вторых, возможен механизм преимущественно гидрофобного взаимодействия молекул ЛФ и ингибина-А. При этом более крупная молекула ЛФ сохраняет доступными свои антигенные детерминанты, а молекулы ингибина-А «укрываются» гидрофобными участками ЛФ и теряют возможность взаимодействовать с антителами.

Способность ЛФ к перекрестной реакции с полимерными соединениями (ДНК, РНК, белками, полисахаридами, различными полианионами), в совокупности с конформационной активностью белка создает дополнительные возможности изменения его биологических свойств и свойств взаимодействующих с ним молекул. Особого внимания заслуживает тот факт, что в присутствии АТФ происходит полная диссоциация мажорной тетрамерной формы ЛФ [5]. При этом происходит разнонаправленное изменение эффективности взаимодействия белка с нуклеиновыми кислотами, полисахаридами и белками. Так, мономерная форма ЛФ проявляет меньшее сродство к полисахаридам и казеину, а эффективность взаимодействия с гепарином изменяется слабо. В то же время АТФ ускоряет ЛФ-зависимый гидролиз ДНК. Есть данные [6] о регуляторной роли изменения олигомерного состояния ЛФ под действием биомолекул, как одного из путей увеличения их функциональных состояний и числа биологических функций. Изменение биологических функций молекул вступающих с ЛФ в интерполимерное взаимодействие, как, в частности, ингибин-А, в высшей степени вероятно, т.к. при интерполимерном взаимодействии обе молекулы подвергаются конформационной модификации.

Таким образом, следует полагать, что в регуляции свойств ингибина человека может участвовать несколько совершенно различных механизмов, которые включают изменение олигомерного состояния белка под действием различных индукторов [8], аллостерическое изменение конформации белка под действием нормальных и патологических метаболитов, например, высоких концентраций эстрогенов, конкурентные концентрации андрогенов и эстрогенов [10], а также образование олигомерных комплексов с ЛФ и , возможно, другими медиаторами и маркерами воспалительной реакции, может быть одой из причин изменения его функционального состояния и снижения биологической активности. Полученные данные являются примером регуляции биологической активности посредством межмолекулярных взаимодействий.

Библиографическая ссылка