Научный журнал

Успехи современного естествознания

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Наволокин Н.А. 1 Мудрак Д.А. 1 Матвеева О.В. 1 Тычина С.А. 1 Бучарская А.Б. 1 Полуконова Н.В. 1 Маслякова Г.Н. 1

---

1 ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития России

Проведено изучение влияния флавоноидсодержащих экстрактов аврана лекарственного (Gratīola officinālis), бессмертника песчаного (Helichrýsum arenárium) и диплоидной антоциановой формы кукурузы обыкновенной (Zea mays) на костный мозг и периферическую кровь при внутримышечном и пероральном введениях в эксперименте на лабораторных крысах с перевитой саркомой 45. Введение каждого из трех исследованных нами растительных экстрактов, содержащих флавоноиды, уменьшает объем перевитой опухоли от 61 до 70 % в зависимости от метода их введения, а также вызывает развитие дистрофических и некротических изменений в опухолевой ткани. У животных перевиваемая опухоль вызывает изменения процентного соотношения ряда клеток в лейкоформуле и миелограмме. Пероральное и внутримышечное введение животным экстрактов кукурузы антоциановой и аврана лекарственного благоприятно влияет на миелоцитарный росток, с приведением показателей к норме, а также приводит к увеличению лимфоцитов как в лейкоформуле крови, так и миелограмме, что, с нашей точки зрения, служит важным звеном в активации иммунной системы и реализации противоопухолевого эффекта экстрактов. Экстракт бессмертника приводит к нормализации процентного соотношения сегментоядерных нейтрофилов, но по большинству показателей не изменяет количественного соотношения клеток по сравнению с контрольной группой животных с опухолью.

Статья в формате PDF

328 KB

флавоноиды

авран

бессмертник

кукуруза

костный мозг

кровь

саркома 45

1. Белоусов Ю.Б., Моисеев В.С., Лепахин В.К. Клиническая фармакология и фармакотерапия. Руководство для врачей. – M., 2010. – 532 с.

2. Байтман Т.П., Наволокин Н.А. Влияние экстракта аврана лекарственного на лабораторных животных с перевитой саркомой S-45 // Бюллетень медицинских интернет-конференций. – 2013. – № 3(2). – С. 374.

3. Гладилин Г.П., Симонова М.И. Гемограмма и миелограмма / учебно-методическое руководство. Кафедра клинической лабораторной диагностики ФПК ППС. – 2004. – С. 37.

4. Кондрашева Е.А., Островский А.Ю. In vitro диагностика. Лабораторная диагностика. – 3-е изд. Перераб. и доп. – М.: Мдиздат, 2012. – С. 840.

5. Наволокин Н.А., Полуконова А.В., Бибикова О.А., Полуконова Н.В., Бучарская А.Б., Маслякова Г.Н. Цитоморфологические изменения клеток почки эмбриона свиньи в культуре (spev-2) при воздействии экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis l.) // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 10, часть 7. – С. 1369–1374.

6. Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н. и др. Морфология внутренних органов и опухоли лабораторных крыс с перевитым раком печени Рс-1 при пероральном введении флавоноидсодержащих экстрактов аврана лекарственного (GratiolaOfficinalis L.) и кукурузы антоциановой (ZeaMays L.) / Саратовский научно-медицинский журнал. – 2013. – № 9(2). – С. 213–220.

7. Полуконова А.В., Дурнова Н.А., Курчатова М.Н. и др. Химический анализ и способ получения новой биологически активной композиции из травы аврана лекарственного (GratiolaOfficinalis L.)/ Химия растительного сырья. – 2013. – № 4. – С. 165–173.

8. Полуконова А.В., Наволокин Н.А., Бибикова О.А. Цитотоксическая активность in vitro экстракта аврана на культуре клеток почек эмбрионов свиньи, зараженных онковирусом / Бюллетень медицинских интернет-конференций. – 2013. – № 3(2) – С. 375.

9. Полуконова А.В., Наволокин Н.А., Райкова С.В., Маслякова Г.Н., Бучарская А.Б., Дурнова Н.А., Шуб Г.М. Противовоспалительная, жаропонижающая и антимикробная активность флавоноидсодержащего экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalisL.) // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2015. – том 78, № 1. – С. 34–38.

10. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. – М.: ОАО «Изд-во «Медицина», 2005. – 832 с.

11. Navolokin N.A., Polukonova N.V., Maslyakova G.N. etc. Effect of extracts of Gratiola officinalis and Zea mays on the tumor and the morphology of the internal organs of rats with transplanted liver cancer / Russian Open Medical Journal. – 2012. – № 2(1). – Р. 0203.

12. Polier G1., Ding J., Konkimalla B.V., Eick D., Ribeiro N., Köhler R., Giaisi M., Efferth T., Desaubry L., Krammer P.H., Li-Weber M. /Wogonin and related natural flavones are inhibitors of CDK9 that induce apoptosis in cancer cells by transcriptional suppression of Mcl-1.//Cell Death Dis. – 2011 Jul 21;2:e182.

Онкологические заболевания занимают одно из ведущих мест в структуре смертности населения во всем мире. Долгое время считалось, что биофлавоноиды, обладающие широким спектром фармакологической активности, не слишком перспективны в плане противоопухолевой активности. Открытие в 2011 году способности растительного флавоноида Вагонина к активации апоптоза в опухолевых клетках [12] сделало актуальным поиск не только других биофлавоноидов, обладающих противоопухолевой активностью, но и выяснение механизмов такой активности.

Ранее нами был разработан способ получения флавоноидсодержащих экстрактов из трех растений: аврана лекарственного, бессмертника песчаного и диплоидной антоциановой формы кукурузы обыкновенной, позволяющий получать нетоксичные или слаботоксичные извлечения даже из ядовитых растений, к которым как раз и относился авран лекарственный [7]. Были также получены сведения, что данные экстракты обладают антиканцерогенным, антиоксидантным, противоопухолевым, иммуномодулирующим [2, 5, 6, 8] и антимикробным действиями [9]. Однако детального анализа токсичности исследуемых флавоноидсодержащих растительных экстрактов, а именно анализа их влияния на лейкоцитарную формулу крови и костный мозг, до сих пор не проводилось.

Цель работы: изучить влияние флавоноидсодержащих экстрактов аврана лекарственного (Gratīola officinālis), бессмертника песчаного (Helichrýsum arenárium) и диплоидной антоциановой формы кукурузы обыкновенной (Zea mays) на костный мозг и периферическую кровь при внутримышечном и пероральном введениях в эксперименте на лабораторных крысах с перевитой саркомой 45.

Материалы и методы исследования

В работе использовали экстракты, полученные запатентованным нами способом двойной спиртовой экстракции с последующим осаждением неполярных веществ (алкалоидов и гликозидов и др.) хлороформом из следующего сырья: листьев и цветков аврана лекарственного, цветков бессмертника песчаного и листьев обертки антоциановой формы кукурузы обыкновенной [7]. Растительное сырье было собрано на территории Саратовской области: на островах Волгоградского водохранилища в районе с. Чардым; пойме р. Медведица Лысогорского района. Сырье кукурузы антоциановой, выращенной на экспериментальном участке в окрестностях г. Петровска, было предоставлено нам сотрудниками кафедры генетики и дарвинизма СГУ им. Н.Г. Чернышевского.

Стандартизацию флавоноидсодержащих экстрактов проводили по кверцетину и рутину. Среднее значение кверцетина в экстракте аврана, определенное по градуировочному графику с использованием стандартного образца кверцетина (Sigma, 98 %), не должно было быть ниже 0,66 %; количество кверцетина, в сухом остатке экстрактивных веществ (на 350 мг экстрактивных веществ), установленное методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) – не должно было быть ниже 350 мкг.

В экстракте бессмертника среднее значение кверцетина в смеси, установленное методом ВЭЖХ, не должно было быть ниже 0,3 мкг/мл, а количество кверцетина в сухом остатке (на 350 мг экстрактивных веществ) – не ниже 150 мкг; найдено количество флавоноидов в пересчете на рутин, определенное методом молекулярной абсорбционной спектроскопии – не ниже 29,40 мкг/мл; массовое процентное содержание флавоноидов в экстракте – не ниже 21,0 %.

Среднее значение полученных определений кверцетина в смеси экстракта кукурузы, установленное нами методом ВЭЖХ, не должно было быть ниже 0,7 мкг/мл; количество кверцетина в сухом остатке (на 260 мг экстрактивных веществ) – не ниже 350 мкг; найдено количество флавоноидов в пересчете на рутин, определенное методом молекулярной абсорбционной спектроскопии – не ниже 16,46 мкг/мл; массовое процентное содержание флавоноидов в экстракте – не ниже 15,8 %.

В эксперименте, проводимом в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ [10], было использовано 48 самцов белых беспородных крыс линии Wistar массой 152 ± 12 г, в возрасте 3 месяцев (по 6 животных в группе). Саркома 45 перевивалась подкожно в область между лопатками в виде 25 %-й взвеси культуры клеток в растворе Хенкса.

В качестве контроля были сформированы две группы: группа контроля № 1 –«здоровые» животные без воздействия и без опухоли; группа контроля № 2 – животные с перевитой саркомой-45 без воздействия. Двойной контроль в данном эксперименте был необходим для исключения развивающихся изменений под влиянием перевитой опухоли.

Оставшиеся животные были разделены на шесть опытных групп: первые две группы получали экстракт бессмертника: группа № 3 – внутримышечно в дозе 1 г/кг; № 4 –перорально в дозе 1 г/кг. Следующие две группы получали экстракт кукурузы: группа № 5 –внутримышечно в дозе 0,32 г/кг; № 6 – перорально в дозе 0,32 г/кг. Следующие две группы получали экстракт аврана: № 7 – внутримышечно в дозе 0,11 г/кг; № 8 – перорально в дозе 0,11 г/кг. Рабочая концентрация растворов экстрактов составляла 100 мг/мл.

Дизайн эксперимента. Животных вводили в эксперимент через 72 часа после перевивки опухоли (саркомы-45) и вводили перорально и внутримышечно экстракты ежедневно в течение двух недель. Внутримышечное введение осуществлялось стерильными инсулиновыми шприцами поочередно в мышцы правых и левых задних лап животных. Пероральное введение осуществляли при помощи желудочных зондов. Перед введением экстракта ежедневно рассчитывали дозу водного раствора каждого экстракта для каждого животного, исходя из определения его массы. Таким образом, достигали постоянства концентрации действующего агента на килограмм массы животного.

По истечении двух недель животных выводили из эксперимента путем декапитации. Определяли объем опухоли и производили забор периферической крови и костного мозга из бедренной кости и опухоли, которая взвешивалась.

Окраску мазков крови и костного мозга осуществляли стандартными методами. Проводили количественную и качественную оценки мазков крови. В мазках крови производили подсчет не менее 100 клеток, а затем вычисляли процентное соотношение клеток и определяли лейкоцитарную формулу.

Мазки костного мозга фиксировали в течение пяти минут раствором фиксатора – красителя эозина метиленового синего по Май-Грюнвальду, затем окрашивали 20 минут красителем по Романовскому. Подсчет проводили под большим увеличением (x1000), на не менее чем 500 клетках и рассчитывали их процентное соотношение (миелограмму) [3].

Для обработки полученных данных использовалось статистическое программное обеспечение SPSS v.20.0 с вычислением средней и ее стандартной ошибки, проведением дисперсионного анализа на нормальность распределения. Распределение признаков в группах являлось нормальным, поэтому значимость различий при параметрическом распределении определяли при помощи t-Критерия Стьюдента для независимых выборок, достоверными отличия считали при p < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Изменения лейкоцитарной формулы крови. При сравнении показателей в двух контрольных группах: здоровых животных и животных с перевитой опухолью без воздействия – отмечали увеличение (p < 0,05) палочкоядерных нейтрофилов и лимфоцитов и уменьшение сегментоядерных нейтрофилов в группе животных с опухолью (табл. 1).

При внутримышечном и пероральном введении экстракта бессмертника опухолью не обнаружено значимых изменений в крови по сравнению с контрольной группой животных № 2 с (табл. 1).

При внутримышечном и пероральном введении экстракта кукурузы наблюдали увеличение (p < 0,05) количества палочкоядерных лейкоцитов в 1,6 и на 1,26 раза соответственно, по сравнению с контрольной группой № 2 (табл. 1).

При пероральном введении экстракта аврана отмечали увеличение (p < 0,05) в 1,4 раза количества сегментоядерных лейкоцитов по сравнению с группой контроля № 2 (табл. 1).

Изменения в миелограмме

Недифференцированные бласты (табл. 2). Сравнительный анализ изменений процентного соотношения клеток в миелограмме у животных из двух контрольных групп показал уменьшение в два раза недифференцированных бластов в группе животных с опухолью по сравнению со здоровыми животными. При пероральном и внутримышечном введении экстрактов аврана и кукурузы отмечали увеличение недифференцированных бластов по сравнению с группой контроля № 2 и приближение значений к здоровым животным (гр. контроля № 1). Только при введении экстракта бессмертника (пероральном и внутримышечном) не наблюдали восстановления процентного соотношения недифференцированных бластов.

Миелобласты (табл. 2). При сравнении двух контрольных групп наблюдали уменьшение (p < 0,05) миелобластов в два раза в группе контроля № 2 по сравнению со здоровыми животными. Анализ показателей в экспериментальных группах показал, что введение всех трех экстрактов способствует нормализации данного показателя, при этом в большей степени при введении экстракта кукурузы (достоверные отличия с группой контроля № 2, в которой из-за опухолевой интоксикации данный показатель снижается) и в меньшей степени – при авране и бессмертнике.

Нейтрофильные промиелоциты (табл. 2). В контрольной группе животных № 2 (с опухолью) отмечали уменьшение в 1,4 раза нейтрофильных промиелоцитов по сравнению с контрольной группой здоровых животных № 1. В опытных группах при пероральном и внутримышечном введениях экстрактов кукурузы, аврана, а также пероральном введении экстракта бессмертника наблюдали тенденцию приближения полученных показателей в контрольной группе здоровых животных, а при пероральном введении аврана показатель достигал значений нормы и отличался от группы № 2 с опухолью, но без воздействия. При внутримышечном введении бессмертника наблюдали дальнейшее уменьшение количества нейтрофильных промиелоцитов (в 2,6 раза по сравнению со здоровыми животными).

Нейтрофильные миелоциты (табл. 2). В группе животных с опухолью без воздействия (группа контроля № 2) было выявлено уменьшение (в 2,5 раза) показателя нейтрофильных миелоцитов по сравнению с группой здоровых животных. В опытных группах с пероральным введением аврана и бессмертника тенденция к уменьшению нейтрофильных миелоцитов продолжается, хотя полученные показатели статистически недостоверны. Во всех остальных экспериментальных группах количество нейтрофильных миелоцитов после введения экстрактов увеличивается и приближается к показателям здоровых животных. Но только при пероральном введении кукурузы отмечали достоверное увеличение в 2,3 раза по сравнению с группой контроля с опухолью и возвращение показателя к норме.

Со стороны нейтрофильных метамиелоцитов и нейтрофильных палочкоядерных лейкоцитов статистически достоверных изменений не обнаружено.

Нейтрофильные сегментоядерные лейкоциты (табл. 2). В контрольной группе № 2 наблюдали увеличение нейтрофильных сегментоядерных лейкоцитов, по сравнению с группой здоровых животных. В опытных группах отмечали тенденцию к уменьшению клеток данного типа. Лишь в группе животных с пероральным введением экстракта бессмертника наблюдали уменьшение в 1,19 раза количества нейтрофильных сегментоядерных лейкоцитов.

Эозинофилы (табл. 2). В контрольной группе животных с опухолью количество эозинофилов увеличивается в 1,9 раза по сравнению со здоровыми животными, что согласуется с литературными данными, согласно которым интоксикация на фоне некротизации опухоли может приводить к увеличению эозинофилов в крови [4]. Следует отметить, что описываемые нами изменения соотношения клеток в миелограмме не сопровождались увеличением количества эозинофилов в крови.

В опытных группах при введении всех трех экстрактов наблюдали отсутствие достоверных изменений доли эозинофилов по сравнению с контрольной группой животных с опухолью. И только при пероральном введении бессмертника наблюдали увеличение количества эозинофилов по сравнению с контрольной группой животных с опухолью.

Пронормобласты (табл. 2). В группе контроля животных с опухолью наблюдали уменьшение в 1,5 раза пронормобластов по сравнению со здоровыми животными. В опытных группах введение экстрактов кукурузы и аврана приводит данный показатель миелограммы к показателям здоровых животных. Экстракт бессмертника при обоих методах введения не способствует изменению доли пронормобластов по сравнению с контрольной группой № 2 с опухолью.

Полихроматофильные нормобласты (табл. 2). Содержание полихроматофильных нормобластов между контрольными группами достоверно не изменяется. В опытных группах при внутримышечном введении экстракта аврана отмечали увеличение в 1,7 раза по сравнению с контрольной группой животных с опухолью и в 1,4 раза – по сравнению со здоровыми животными. В группе с пероральным введением кукурузы показатели полихроматофильных нормобластов достоверно отличаются только по сравнению со здоровыми животными контрольной группы № 1.

Лимфоциты (табл. 2). Количество лимфоцитов в миелограмме между группами контроля достоверно не отличается. Достоверное уменьшение доли лимфоцитов происходит при пероральном и внутримышечном введениях экстрактов аврана и кукурузы.

На количество нейрофильных метамиелоцитов, нейтрофильных палочкоядерных, базафилов, эритробластов, нормобластов, нормобластных базофилов, оксифильных нормобластов, моноцитов, плазматических клеток в процентом соотношении экстракты аврана, кукурузы и бессмертника влияния не оказывают (табл. 2).

Влияние экстрактов на рост саркомы 45 (табл. 3).

При пероральном и внутримышечном введении экстракта аврана отмечали статистически достоверное уменьшение объема опухоли на 63 % и 57,4 %, соответственно.

Таблица 1

Показатели лейкоцитарной формулы периферической крови крыс при введении флавоноидсодержащих экстрактов

Примечания. Значимость отличий определяли между контрольными группами, контрольными животными № 1 и экспериментальными группами – (А), группой контроля № 2 и экспериментальными группами – (Б); * – достоверные отличия при p < 0,05; ** – достоверные отличия при p < 0,01.

Библиографическая ссылка