Научный журнал
Успехи современного естествознания
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

СОХРАННОСТЬ И ПЕРЕХОД МЕЖДУ ФОРМАМИ АНТОЦИАНОВ В РАСТВОРАХ

Дейнека Л.А. 1 Блинова И.П. 1 Кульченко Я.И. 1 Озер П.С. 1 Саенко И.И. 1 Дейнека В.И. 1
1 ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»
Проведен анализ требования выдержки растворов антоцианов при рН = 1 в течение 15 мин (и не более 1 ч) по используемой во всем мире методике и по ГОСТ, принятому в РФ. В исследовании использованы экстракты трех растительных источников – плодов черники и паслена черного, а также оберток пурпурной кукурузы. Из стартового экстракта были приготовлены три раствора с различными значениями рН. Перед спектрофотометрическим определением из каждого из них были приготовлены растворы с рН = 1, оптическую плотность которых контролировали в течение времени, превышающего нормативный 1 час. В итоге было показано, что в общем случае время, необходимое для установления равновесия после скачкообразного уменьшения кислотности от рН = 3 (имитация среды соков) и рН = 4,5 до рН = 1 может превышать сутки; но процесс более чем на 98?% завершается при выдержке в течение 6 ч. По этой причине недоопределение антоцианов при выдержке раствора при рН = 1 менее 1 ч может достигать 8–9?%. Кроме того, установлено, что выдержка экстрактов неацилированных антоцианов при рН = 3 или 4,5 может привести к безвозвратным потерям от 10 до 20?% антоцианов исходного экстракта, увеличивающимся с ростом выдержки при этих рН; в случае ацилированных антоцианов потери значительно снижаются.
спектрофотометрия
антоцианы
соотношение форм
растворы
рН
стабильность
скорость
1. ГОСТ Р 53773-2010. Продукция соковая. Методы определения антоцианинов.
2. Дейнека В.И., Гостищев Д.А., Дейнека Л.А. Изучение состава и строения ацилированных антоцианов плодов Solanum melongena, Capsicum annuum и Solanum nigrum / Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: материалы IV Всероссийской конференции. 21–23 апреля 2009 г. Кн. 2. – Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, 2009. – С. 245–247.
3. Дейнека В.И., Григорьев А.М., Дейнека Л.А. и др. // Зав. лаб. – 2006. – № 3. – С. 16–20.
4. Третьяков М.Ю., Хорошилов С.А., Сидоров А.Н., и др. // Достижения науки и техники АПК. – 2012. – № 9. – С. 30–32.
5. Anthocyanins. Biosynthesis, Functions, and Applications / Ed. Kevin Gould, Kevin Davies, Chris Winefield. – Springer Science + Business Media, LLC. 2009. – 329 p.
6. Giusti M.M., Wrolstad R.E. Characterization and Measurement of Anthocyanins by UV-Visible Spectroscopy / In R.E. Wrolstad (Ed.), Handbook of analytical food chemistry. – New York: John Wiley & Sons, 2005. – Unit F1.2.
7. B?kowska-Barczak A. Acylated anthocyanins as stable natural food colorants – a review // Pol. J. Food Nutr. Sci. – 2005. – Vol. 14/55, № 2. – P. 107–116.
8. Brouillard R., Lang J. The hemiacetal-cis-chalcone equilibrium of malvin, a natural anthocyanin // Can. J. Chem. – 1990. – Vol. 68. – P. 755–761.
9. Preston N.W., Timberlake C.F. Separation of anthocyanin chalcones by high-performance liquid chromatography // J. Chromat. – 1981. – Vol. 214. – P. 222–228.
10. Stinzing F.C., Stinzing A.S., Carle R. et al // J. Agric. Food Chem. – 2002. – Vol. 50. – P. 396–399.

Антоцианы являются подклассом флавоноидов, их особенность – высокая растворимость в воде, существование в растворах нескольких рН-зависимых и независимых форм, некоторые из которых обладают окраской, а также высокая антиоксидантная активность и связанная с ней высокая биологическая активность [3]. В сфере интересов ученых антоцианы находятся с начала 20-го века, поэтому к настоящему времени накоплена обширная информация о свойствах этих соединений, которая, к сожалению, не всегда учитывается в современных работах. Так, например, при спектрофотометрическом определении антоцианов [1, 6] в пересчете на цианидин-3-глюкозид (или на мальвидин-3-глюкозид), выполняемом по принятой во всем мире методике, измеряют оптическую плотность растворов при двух рН для исключения из суммы полимерных антоцианов. При этом, во-первых, не совсем понятно, зачем делают такое исключение, поскольку никто не анализировал влияние присутствия полимерных антоцианов ни на красящие свойства, ни на антиоксидантные свойства сложных смесей антоцианов. Но, во-вторых, наиболее любопытно требование выдержки раствора после понижения установления рН (1,0 или 4,5) 15 мин и не более 1 ч. По мнению авторов [6], при большей выдержке возможно получение завышенных показаний спектрофотометра (All measurements should be made between 15 min and 1 hr after sample preparation, since longer standing times tend to increase observed readings). Это довольно странно, поскольку дополнительный биосинтез антоцианов в экстрактах при рН = 1, представляется маловероятным. Настоящая работа посвящена экспериментальному анализу обоснованности данного требования.

Экспериментальная часть

Для проведения исследований в настоящей работе были выбраны антоцианы экстрактов плодов паслена черного и черники, а также антоцианы экстракта оберток пурпурной кукурузы. Антоцианы первого источника представлены ацилированными гидроксикоричными кислотами 3,5-дигликозилированных производных антоцианидинов дельфинидинового ряда [2]; они были выбраны в качестве наиболее стабильных (по литературным данным) антоцианов [7]. Во втором случае в экстракте обнаруживают сложную смесь простых моногликозидов антоцианидинов дельфинидинового и цианидинового рядов [3], а в третьем случае в антоциановом комплексе превалируют производные только цианидина, большей частью ацилированные малоновой кислотой [4].

Экстракты получали настаиванием растительного материала в 0,1 М водном растворе HCl с последующим отделением экстракта от остатка фильтрованием через бумажный фильтр. Заданное значение рН (перед пробоподготовкой к спектрофотометрическому определению) устанавливали добавлением к аликвотной порции экстракта 1 М водных растворов HCl и NaOH с потенциометрическим контролем реакции среды (рН-метр Эксперт-рН, стеклянный комбинированный электрод ЭСК-1). Перед измерением оптической плотности растворов (спектрофотометр Shimadzu UV-2550, кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см) растворы готовили по методике [6].

Результаты исследования и их обсуждение

В средах от сильнокислых до слабокислых антоцианы могут существовать в виде четырех различных структур, между которыми устанавливается равновесие. Наиболее важна (как природный краситель) флавилиевая форма, I, в водных растворах окрашенная в красные тона – от оранжевого до синеватого оттенков (λmax = 490–530 нм), – в зависимости от строения. Считается, что при рН = 1 и ниже на ее долю в растворах приходится основная часть антоцианов. При повышении рН флавилиевая форма переходит в форму псевдооснования (полуацетальную), II. Эта форма не окрашена, – максимум абсорбции находится в коротковолновой области (около 270 нм). Полуацетали изомеризуются до цис- и транс-халконных форм (III и IV), которые должны иметь лишь немногим более длинноволновые максимумы абсорбции в УФ-диапазоне (330 и более нм) (рис. 1).

pic_40.wmf

Рис. 1. Равновесия между четырьмя формами антоцианов

Рассмотрим равновесие (a) между флавилиевой формой антоцианов (A+, I) и полуацетальной (B, II), которое можно представить уравнением

A+ + Н2О = В + Н+. (1)

Такое равновесие описывается кажущейся константой равновесия (К):

dayneka01.wmf (2)

Если при одинаковой суммарной концентрации антоцианов изменять рН раствора, то характеристическая (для многих производных цианидина с максимумом абсорбции в районе 510–515 нм) окраска раствора будет ослабевать вследствие образования бесцветной полуацетальной формы В:

dayneka02.wmf (3)

Введенная константа K* определяется как К·[H2O]. При этом результаты моделирования изменения окраски, представленные на рис. 2, показывают, что для значений констант на границах интервала (0,001; 0,003) следует ожидать недоопределения антоцианов из-за неполного превращения (на 1 и 3 % соответственно) их во флавилиевую форму, а также из-за неполного обесцвечивания (на 3 и 1 % соответственно) при переходе в форму полуацеталя. При этом как рост, так и уменьшение константы приведет только к увеличению недоопределения антоцианов из-за крутых спуска и подъема кривых на рис. 2.

pic_42.tif

Рис. 2. Моделирование изменения интенсивности окраски раствора антоцианов в зависимости от рН и константы гидратации флавилиевого иона: К* = 0,001 (1) и 0,003 (2)

Вовлечение халконных форм (при установлении равновесия) ничего не меняет, поскольку равновесие между этими формами не зависит от рН. Таким образом, выбор рН трудно считать обоснованным. Действительно, тенденция к снижению оптической плотности при повышении рН ниже рН = 4,5 была установлена нами для ряда экстрактов. Впрочем, значительное повышение рН может привести к появлению окрашенных хиноидных структур, а неполнота определения антоцианов при использовании указанных рН может быть скорректирована изменением (уменьшением на 4 %) коэффициента молярного погашения. Следует также учитывать, что предложение добавлять к экстракту более чем четырехкратного объем ацетатного буфера, без контроля рН полученного раствора, строго говоря, некорректно. Растительные экстракты также представляют собой буферные растворы, поэтому и буферной емкости добавки может не хватить для достижения рН = 4,5.

Из литературных данных известно, что равновесия (рис. 1, а и б) устанавливаются быстро, но равновесие (рис. 1, в) – очень медленно [8], хотя представить себе возврат менее напряженной структуры IV в стерически напряженную структуру III трудно. В другой работе [9] в качестве медленной стадии рассматривается переход II в III, а возврат трансхалконной формы IV в III и далее через II в I возможен при УФ-облучении или под действием кислотного катализа.

В настоящей работе мы исследовали поведение в растворах не индивидуальных соединений, а экстрактов, которые кроме антоцианов могут содержать сопутствующие экстрактивные вещества; именно этот случай имеет первостепенное значение для реального определения суммы антоцианов в исследуемых объектах. При этом эксперимент был проведен так, что каждый из исходных экстрактов делили на три равные части, создавая в одной из них рН = 1 (что требуется по методике [1]). В другой части рН повышали до ~3 (имитация соков или иных прохладительных напитков, которые могут быть стартовым материалом), а в третьей – рН ~ 4,5 (для полного, по мнению составителей методик [1, 6], перехода антоцианов из I в II–IV. Затем после выдержки в течение примерно 1 ч получали по три раствора для каждого объекта с одинаковой суммарной концентрацией антоцианов, в которых рН был возвращен до рН = 1 – для определения антоцианов.

В результате выполненных исследований было установлено, что в случае экстракта плодов черники всех трех растворов (с рН = 1; 3 и 4,5) после возврата к рН = 1 наблюдается далеко не мгновенное превращение всех форм в I (рис. 3). Выдержка раствора даже в течение 1 ч (не говоря уже о 15 мин) недостаточна для возврата к равновесной концентрации флавилиевой формы – недоопределение антоцианов по методикам, предложенным в [1, 6], находится на уровне 2,5–3,5 процентов и вырастает до 5–7 % при выдержке в течение 15 мин. При этом увеличение выдержки до 1 суток (по нашим данным) приводит обычно к росту оптической плотности растворов еще на 1–2 %, хотя иногда этот рост компенсируется разрушением антоцианов.

pic_43.tif

Рис. 3. Превращение во флавилиевую форму антоцианов плодов черники при возврате рН к 1 от трех различных стартовых рН*

pic_44.tif

Рис. 4. Возврат к флавилиевой форме антоцианов плодов черники после хранения при рН = 4,5 в течение 0; 1 и 2 суток (числа в скобках) после возврата к рН = 1

При исследовании стабильности антоцианов растворы выдерживали при рН = 3 и при рН = 4,5 в течение 0, 1 и 2-х суток с последующим возвратом к рН = 1. В результате выполненной работы было установлено, что необратимые потери антоцианов даже при небольшой выдержке оказываются весьма значительными – от 10 до 21 % при минимальной выдержке и с тенденцией к росту потерь с увеличением рН промежуточного раствора и времени выдержки такого раствора (рис. 4).

Причин таких потерь может быть несколько – от окисления менее устойчивых по отношению к внешним воздействиям форм II–IV до образования формы IV, не превращающейся обратно в III в условиях проведения эксперимента. Дифференциация и определение типа потерь можно выполнить, исследуя индивидуально выделенные антоцианы, но в данной работе мы основное внимание уделяем образцам, для контроля концентрации антоцианов в которых и разработана методика [5]. Но в целом полученные данные не противоречат идее о том, что равновесие (б) устанавливается не мгновенно, а равновесие (в) вообще трудно достичь, при быстрой скорости превращения цис-халконной формы в трансхалконную. Так при рН = 3 на долю флавилиевого иона может приходиться менее половины антоцианов (по графику на рис. 2), а при рН = 4,5 флавилиевая форма остается только в небольших количествах (до 5 %). То есть доля, приходящаяся на полуацетальную форму, в первом случае изначально примерно вдвое меньше, чем во втором. Соответственно, в тех же соотношениях будут находиться цис-халконные формы, и тогда понятно, почему безвозвратных потерь (из-за перехода в транс-форму) во втором случае вдвое больше, чем в первом. В принципе, увеличение невозвратных потерь с ростом времени выдержки раствора при «неблагоприятных» для флавилиевой формы рН, рис. 4, также укладывается в высказанную идею, хотя для строгих выводов следует провести работу по исключению возможности окисления продуктов кислородом воздуха.

Для аналогичного эксперимента с экстрактом плодов паслена черного безвозвратные потери антоцианов оказались существенно меньшими (около 5 % при минимальной выдержке растворов), что подтверждает большую устойчивость антоцианов, ацилированных замещенными коричными кислотами, по сравнению с простыми гликозидами антоцианидинов [7]. Причиной такой устойчивости может быть стабилизация форм I и II за счет внутримолекулярного стэкинга – упаковки кольца В флавилиевой основы и ароматического кольца радикала пара-кумаровой кислоты, ацилирующей рутинозидный фрагмент структуры. Такой стэкинг-эффект может обеспечить жесткость конструкции антоцианов и, как следствие, к большим энергетическим барьерам на пути превращения псевдооснования в халконные формы.

В случае антоцианов оберток початков кукурузы, особенность которых – ацилирование малоновой кислотой, невозвратные потери антоцианов также не превышали 5 %, но наблюдался более медленный и длительный возврат к флавилиевой форме. Такое поведение не удивительно, поскольку повышение стабильности (без указания причин этого повышения) для антоцианов, ацилированных алифатическими, особенно дикарбоновыми кислотами, известно [10]. Для этого объекта для завершения рассматриваемого процесса необходима выдержка раствора в течение суток и более, поэтому по [1, 6] недоопределение антоцианов превысит 6 %.

Таким образом, при определении общего содержания антоцианов по методикам [1, 6] в общем случае требуется выдержка раствора с рН = 1 в течение не менее 6 ч. Но лучше рекомендовать выдержку в течение ночи, например, сопряженную с экстракцией антоцианов из растительного материала.


Библиографическая ссылка

Дейнека Л.А., Блинова И.П., Кульченко Я.И., Озер П.С., Саенко И.И., Дейнека В.И. СОХРАННОСТЬ И ПЕРЕХОД МЕЖДУ ФОРМАМИ АНТОЦИАНОВ В РАСТВОРАХ // Успехи современного естествознания. – 2016. – № 2. – С. 16-20;
URL: https://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=35779 (дата обращения: 23.05.2022).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074