Научный журнал

Успехи современного естествознания

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Степаненко И.С. 1 Ямашкин С.А. 2 Акулина И.В. 3 Котькин А.И. 2 Костина Ю.А. 1

---

1 ФГБОУ ВО «Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева»

2 ФГБОУ ВО «Мордовский государственный педагогический институт им. М.Е. Евсевьева»

3 ФГБОУ ВО «Чувашский государственный университет им. И.Н Ульянова»

Каждое новое химическое соединение, если в перспективе предполагается его использование в качестве лекарственного препарата, должно быть безопасным для макроорганизма. Целью данного исследования явилось изучение цитотоксичности in vitro производных аминоиндола и пирролохинолинов, проявляющих противомикробную и противогрибковую активность. В работе была использована линия опухолевых клеток HeLa (ATCC ® CCL-2TM), полученная из коллекции банка глубокозамороженных клеточных культур ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. В ходе исследования отмечалась тенденция увеличивать количество метаболически активных клеток, что может свидетельствовать о митогенном эффекте изучаемых соединений. Результаты исследования соединений на культуре клеток HeLa представляют интерес для дальнейшего изучения с целью разработки новых противомикробных препаратов, не обладающих цитотоксическим эффектом.

Статья в формате PDF

0 KB

цитотоксичность

культура клеток

производные аминоиндола и пирролохинолинов

противомикробные соединения

1. Аникина Л.В., Пухов С.А., Дубровская Е.С., Афанасьева С.В., Клочков С.Г. Сравнительное определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ и ресазурина // Фундаментальные исследования. – 2014. – № 12–7. – С. 1423–1427.

2. Жернов Ю.В. Анализ цитотоксичнсоти гуминовых веществ пелоидов. // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. – 2011. – Т. 13, № 1(8). – С. 1996–1998.

3. Кадималиев Д.А., Степаненко И.С, Надежина О.С., Ямашкин С.А. Влияние различно-замещенных пирролохинолинов на физиологобиохимические характеристики лигнолитического гриба Lentinus tigrinus // Микология и фитопатология. – Вып.5. – Т. 48. – 2014. – С. 309–314.

4. Степаненко И.С., Котькин А.И., Ямашкин С.А. Изучение противомикробной активности фторзамещенных пироллохинолинов // Фундаментальные исследования. – 2013. – № 8–6. –С. 1406–1410.

5. Степаненко И.С., Котькин А.И., Алямкина Е.А., Ямашкин С.А. Противомикробная активность производных 6-амино-5-метил-2-фенил- и 6-амино-1,5-диметил-2-фенилиндолов // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – № 5; URL: www.science-education.ru / 128-22043.

6. Степаненко И.С., Ямашкин С.А., Котькин А.И. Биологическая активность и анализ масс-спектрального распада трифторметилпирролохинолинов // Успехи современного естествознания. – 2016. – № 8. – С. 55–60.

7. Cancer cell culture: methods and protocols / Ser. Methods in Molecular Medicine. Vol. 88. (Ed. S.P. Langdon) // Totowa, NJ: Humana Press, 2003. – Р. 165–169.

8. In vitro toxicity testing protocols / Ser. Methods in Molecular Biology. (Eds S.O’Hare, C.K. Atterwill). // Totowa. – NJ: Humana Press, 1995. – Vol. 43. – Р. 138–149.

9. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay // J. Immunol. Meth. – 1983. – Vol. 65, № 1–2. – P. 55–63.

10. Zhang Z. Synthesis of isomeric analogs of coenzyme pyrroloquinoline quinine (PQQ) / Z. Zhang, L.M.V. Tillekeratne, R.A. Hudson // Synthesis. – 1996. – № 3. – P. 377.

Производные аминоиндола и пирролохинолины как биологически активные вещества представляют большой интерес для исследования. Среди физиологически активных соединений как природного, так и синтетического происхождения азотистые гетероциклические системы занимают ведущее место. Наиболее интересными и перспективными являются производные хинолина и индола, а следовательно, пирролохинолина, в молекуле которого сочетаются указанные фармакофорные фрагменты. Самый молодой витамин, классифицированный как витамин группы В, по химической структуре представляет собой трициклический о-хинон-2,7,9-трикарбокси-1Н-пирроло[2,3-f]хинолин-4,5-дион, он обнаружен в живых системах как кофермент окислительно-восстановительных ферментов – PQQ (метоксатин). Он широко распространен в продуктах растительного происхождения: в плодах цитрусовых, киви, папайе, петрушке, перце, зеленом чае, а также в небольших количествах содержится в мясе, яичных желтках, женском молоке. Пирролохинолиновые аналоги PQQ представляют собой соединения, которые могут служить заменой природного вещества и могут быть использованы как антиоксиданты или как окислительно-восстановительные коферменты в ферментных системах [10]. Установлено, что биологическая активность PQQ зависит от характера заместителя в пирролохинолиновом кольце. Так, трициклический о-хинон-2,7,9-трикарбокси-1Н-пирроло[2,3-f]хинолин-4,5-дион в живых организмах является коферментом в окислительно-восстановительных системах, в то время как изученные трифторметилпроизводные PQQ обладают противомикробной и противогрибковой активностью. Нами проведена большая работа по исследованию антимикробной и противогрибковой активности данных соединений [3, 4, 5, 6]. Целью дальнейшего исследования стало изучение биологической безопасности данных соединений, так как в перспективе мы предполагаем их использование в составе лекарственных средств.

Цель исследования: изучить цитотоксичность производных аминоиндолов и пирролохинолинов с лабораторными шифрами 4Д (1,2,3,9-тетраметил-6-трифторметил-1,9-дигидро-8H-пирроло[3,2-h]хинолин-8-он), НД (6-гидрокси-2,3-диметил-6-трифторметил-1,6,7,9-тетрагидро-8H-пирроло[3,2-h]хинолин-8-он), 39Д (1,5-диметил-2-фенил-8-трифторметил-1,5-дигидро-6H-пирроло[3,2-g]хинолин-6-он), 66’ (4,4,4трифтор-N-(6-метокси-2,3-диметил-1H-индол-5-ил)-3-оксобутанамид), 64Д (4,4,4трифтор-3-оксо-N-(2,3,6-триметил-1H-индол-5-ил)бутанамид), 66Д (4,4,4трифтор-N-(6-метокси-1,2,3-триметил-1H-индол-5-ил)-3-оксобутанамид), 43Д (4,4,4трифтор-N-(6-метил-2-фенил-1H-индол-5-ил)-3-оксобутанамид) in vitro на линии опухолевых клеток HeLa (ATCC ® CCL-2TM).

Материалы и методы исследования

В работе была использована линия опухолевых клеток HeLa (ATCC ® CCL-2TM), полученная из коллекции банка глубокозамороженных клеточных культур ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

HeLa представляет собой эпителиальные клетки аденокарциномы шейки матки человека, прилипающие к подложке (рис. 1).

Эпителиальные клетки аденокарциномы шейки матки человека (HeLa ATCC ® CCL-2TM)

Опухолевые клетки культивировали в среде RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) (ПанЭко, Россия), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки, 10 мМ буфера Hepes (4-(2-оксиэтил)1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в пластиковых флаконах для культур клеток (Corning Costar, США) при 37 °С, 100 % влажности и 5 % содержании углекислого газа в окружающем воздухе. Пассирование клеточной культуры производили каждые 3 дня.

Во время пересева клетки снимали с поверхности пластикового флакона смесью раствора Версена (ПанЭко, Россия) и 0,25 % раствора трипсина (ПанЭко, Россия) (в соотношении 1:1) в течение 3–5 мин при 37 °С. После «ошпаривания» клеток и открепления их от дна флакона трипсин инактивировали добавлением питательной культуральной среды с 10 % эмбриональной телячьей сывороткой (ПанЭко, Россия).

В экспериментальных исследованиях широкое распространение для оценки лекарственной цитотоксичности получил МТТ-тест, (скрининговый метод измерения выживаемости клеток). Данный тест основан на способности митохондриальных дегидрогеназ живой метаболически активной клетки конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-етразолиум бромид (МТТ) в формазан, который выпадает в виде кристаллов внутри клетки. Растворение формазана с помощью диметилсульфоксида (ДМСО) и последующая фотометрия цветного (фиолетового) раствора позволяют сопоставить изменение оптической плотности раствора в опытных лунках по отношению к контрольным и, таким образом, косвенно оценить долю погибших клеток под влиянием изучаемого агента [7, 8].

В настоящей работе МТТ-тест проводили с использованием культуры клеток HeLa, по методике, описанной Mosmann Т. [9]. Клетки рассевали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета для культур клеток в концентрации 104 – 2*104 кл/лунка и инкубировали при 37 °С, 100 % влажности и 5 % содержании углекислого газа в окружающем воздухе. После формирования монослоя производили замену полной культуральной среды, содержащей 10 % эмбриональную телячью сыворотку, на среду с низким содержанием сыворотки (1 % эмбриональной телячьей сыворотки) для стационирования культуры и вносили исследуемые соединения. Длительность инкубации с опытными веществами в концентрациях 2 мкг/мл, 20 мкг/мл, 200 мкг/мл составляла 48 ч. За 4 часа до окончания инкубации в каждую лунку вносили 20 мкл раствора МТТ (матричный раствор 5 мг/мл) (ПанЭко, Россия) и инкубировали на протяжении еще 4 ч. По окончании инкубации среду осторожно удаляли, а в каждую лунку добавляли по 200 мкл ДМСО (ПанЭко, Россия). Осадок ресуспензировали и растворяли в течение 15 мин, инкубируя в темноте при комнатной температуре. Показания оптической плотности считывали на планшетном ИФА-фотометре (Immunochem 2100, США) при 492 нм. Долю жизнеспособных клеток рассчитывали в процентах по отношению к контролю [1]. Цитотоксичность исследуемое вещество проявляет, если его процентный показатель оптической плотности меньше 70 %. Если показатель оптической плотности превышает 70 %, то данное вещество не проявляет выраженной цитотоксичности на культуру клеток [2].

Результаты исследования и их обсуждение

Для изучения прямой цитотоксичности исследуемых соединений использовался МТТ-тест, который получил широкое распространение в экспериментальных исследованиях. Исследуемые соединения 4Д, НД, 39Д, 66’, 64Д, 66Д, 43Д тестировали в диапазоне концентраций 2-200 мкг/мл в четырех параллельных сравнениях (для каждой концентрации) в 4 сериях экспериментов. Среднее значение для четырех измерений уровня оптической плотности (эквивалент доли метаболически активных/жизнеспособных клеток) выражали в процентах к контролю (таблица).

Определение цитотоксичности исследуемых соединений в МТТ-тесте

Примечание. * – отличие от контроля статистически достоверно при Р < 0,05.

МТТ-тест показал, что при применении 4Д в диапазоне концентраций от 200 до 2 мкг/мл доля жизнеспособных клеток по отношению к контролю колебалась от 88,4 ± 13,2 % до 94,5 ± 11,4 % соответственно (P > 0,05) На фоне введения в культуру опухолевых клеток соединения НД в аналогичных концентрациях жизнеспособность клеток существенно не изменялась, процент жизнеспособности находился в пределах от 71,2 ± 7,58 до 89,1 ± 5,6 %, что статистически недостоверно по отношению к контролю. Показатель цитотоксичности 39Д, добавленного в культуральную среду в дозе 200 мкг/мл, составил 88,2 ± 2,4 % (P > 0,05), в дозе 20 мкг/мл – 81,7 ± 7,4 % (P > 0,05) и в дозе 2 мкг/мл – 97,2 ± 10,8 % (P > 0,05), что подтверждает отсутствие выраженной токсичности in vitro.

В ходе эксперимента было выявлено, что соединение 66’ усиливает пролиферацию исследуемой тест-культуры, его показатель оптической плотности превышает показатель в контроле. Так в дозе 200 мкг/мл доля жизнеспособных клеток по отношению к контролю составила 132,5 ± 7,4 %, в дозе 20 мкг/мл – 118,2 ± 4,5 % (P > 0,05) и в дозе 2 мкг/мл – 109,4 ± 6,2 % (P > 0,05). Внесение 64Д в культуру клеток аденокарциномы шейки матки человека вызывало увеличение количества метаболически активных клеток in vitro в диапазоне концентраций от 200 до 2 мкг/мл. Так, в концентрации 64Д 200 мкг/мл уровень жизнеспособности культуры характеризовался средним значением 105,6 ± 7,7 % (P > 0,05), при использовании 20 мкг/мл – 122,4 ± 12,8 % (P > 0,05), в дозе 2 мкг/мл – 108,7 ± 13,4 % (P > 0,05). Применение 66Д в дозах 20 мкг/мл и 2 мкг/мл приводило также к стимуляции роста клеточной культуры HeLa до 127,9 ± 11,9 % и 110,6 ± 13,1 % соответственно, что статистически недостоверно по отношению к контрольной серии эксперимента. Однако в дозе 200 мкг/мл, показатель оптической плотности был меньше 70 % и составил 69,8 ± 1,3 % (P < 0,05), что свидетельствует о токсичности данного соединения в изучаемой дозе. Аналогичная картина наблюдается при исследовании 43Д. Добавление к культуре клеток высокой дозы (200 мкг/мл) испытуемого агента приводит к снижению жизнеспособности опухолевых клеток до 53,2 ± 1,3 % (P < 0,05), что подтверждает цитотоксичность данной дозы 43Д. Применение 43Д в концентрациях 20 и 2 мкг/мл приводит к пролиферации клеток HeLa до 110,9 ± 12,6 % и 114,8 ± 14,3 % соответственно (P > 0,05).

Необходимо отметить, что в ходе эксперимента у соединений 4Д, НД, 39Д, 66’ наблюдалась зависимость выраженности фармакологического эффекта от концентрации указанных опытных агентов. У соединений 64Д, 66Д и 43Д подобной зависимости не отмечалось.

Таким образом, все изучаемые соединения в исследуемом интервале концентраций не оказывают выраженную цитотоксичность к эпителиальным клеткам аденокарциномы шейки матки человека, за исключением 66Д и 43Д в высоких дозах 200 мкг/мл.

Степень выраженности эффекта у соединений 4Д, НД, 39Д, 66’ зависела от их концентрации in vitro.

Также установлено, что соединения 66’, 64Д в изучаемых дозах и 66Д, 43Д в дозах 20 и 2 мкг/мл проявляют тенденцию к повышению доли жизнеспособных клеток линии аденокарциномы шейки матки человека.

Заключение

В результате исследования отмечалась тенденция увеличивать количество метаболически активных клеток, что может свидетельствовать о митогенном эффекте изучаемых соединений. Полученные данные представляют интерес для дальнейшего изучения действия этих соединений в аспекте снижения побочных эффектов и увеличения терапевтической эффективности.

Библиографическая ссылка