Научный журнал
Успехи современного естествознания
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,653

МИКРОБИОТА УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРАКТА ПАЦИЕНТОК РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА, ИДЕНТИФИЦИРОВАННАЯ НА ОСНОВЕ МАСС-СПЕКТРОВ РИБОСОМАЛЬНЫХ БЕЛКОВ

Евстигнеева Н.П. 1 Аминева П.Г. 1 Герасимова Н.А. 1 Зильберберг Н.В. 1 Кунгуров Н.В. 1
1 ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии» Министерства здравоохранения РФ
Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 373 пациенток в возрасте от 18 до 45 лет, включающее идентификацию микробиоты методом масс-спектрометрического профилирования бактерий и исключение возбудителей ИППП. Наиболее часто выделялись: лактобактерии (69,9 %), дрожжеподобные грибы рода Candida (19,1 %), представители семейства Enterobacteriaceae (18,8 %), бактерии рода Staphylococcus (19,1 %), Streptococcus (13,1 %), Enterococcus (10,4 %), а также G. vaginalis (13,7 %). Благодаря применению высокотехнологичного метода MALDI-TOF MS расширился спектр идентифицируемых видов Streptococcus, Corynebacterium, культивируемых лактобактерий. Встречаемость микробных ассоциаций из 2 условно-патогенных агентов наблюдалась почти у каждой четвертой пациентки с воспалительным процессом урогенитального тракта. Показан алгоритм микробиологического исследования микробиоты влагалища.
микробиота влагалища
масс-спектрометрия
воспалительные заболевания урогенитального тракта
1. Анкирская А.С. Микроэкология влагалища и профилактика акушерской патологии // Гинекология. – 1999. –№ 3. – С. 80–82.
2. Анкирская А.С. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища / А.С. Анкирская, В.В. Муравьева // Клин. микробиолог. антимикроб. химиотер. – 2001. – Т. 3, № 2. – С. 190–194.
3. Мелкумян А.Р. Видовой состав лактобактерий при различном состоянии микробиоты влагалища у беременных /А.Р. Мелкумян, Т.В. Припутневич, А.С. Анкирская, Д.Ю. Трофимов, В.В. Муравьева, С.М. Муллабаева, М.Г. Завьялова // Клин. микробиолог. антимикроб. химиотер. – 2013. – Т. 15, № 1. – С. 72–79.
4. Методики клинических лабораторных исследований: Справочное пособие. Том 3. Клиническая микробиология / Под ред. В.В. Меньшикова. – М.: Лабора, 2009. – С. 51–64.
5. Anderson A.C. Rapid species-level identification of vaginal and oral lactobacilli using MALDI-TOF MS analysis and 16S rDNA sequencing / A.C. Anderson, M. Sanunu, C. Schneider, L. Karygiann, A. Clad, E. Hellwig // BMC Microbiology 2014. – Р. 14:312.
6. Backer E. Quantitative determination by real-time PCR of four vaginal Lactobacillus species, Gardnerella vaginalis and Atopobium vaginae indicates an inverse relationship between L. gasseri and L. iners / E. Backer, R. Verhelst, H. Verstraelen, M. Alqumber, J. Burton, J. Tagg, M. Temmerman and M. Vaneechoutte // BMC Microbiology 2007. Р. 7:115.
7. Donders G.G.G. Aerobic vaginitis in pregnancy / Donders G., Bellen G., Rezeberga D. // International Journal of Obstetrics and Gynaecology, 2011.
8. Donders Gilbert G.G. Definition and classification of abnormal vaginal flora / Gilbert G.G. Donders // Best Practice & Research Clinical Obstetrics and Gynaecology. – 2007. – №. 3. – Р. 355–373.
9. Vasquez A. Vaginal Lactobacillus flora of healthy Swedish women / A. Vasquez, T. Jakobsson, S. Ahrne, U. Forsum, G. Molin // J Clin Microbiol. – 2002; 40:2746–49.

Отличительной особенностью инфекционной урогенитальной патологии в настоящее время является возрастающая роль условно-патогенных микроорганизмов. Отсутствие специфической картины воспаления, во многих случаях бессимптомное течение осложняют диагностику этих заболеваний, что приводит к хронизации процесса, неблагоприятно влияет на репродуктивную функцию, снижает качество жизни. Число оппортунистических инфекций генитального тракта у женщин репродуктивного возраста неуклонно увеличивается, динамично меняется их этиологическая структура и чувствительность к антибиотикам [1, 2, 7, 8]. Особенностью микробиологической диагностики в настоящее время является необходимость четкой довидовой идентификации микроорганизмов. Например, показано, что разные виды лактобактерий имеют неодинаковое значение в патологическом процессе во влагалище: одни виды способствуют поддержанию здоровой среды, другие запускают процесс бактериального вагиноза (Lactobacillus iners) [3, 6, 9]. Поэтому внедрение метода MALDI-TOF (время-пролетной мaсс-спектрометрии) рибосомальных белковых фракций в практическую работу бактериологических лабораторий является крайне перспективным и открывает новые возможности диагностики микробиоты (гемофилы, нейссерии, культивируемые лактобактерии, коринебактерии). Данная методика почти не требует затрат на реактивы и расходные материалы. Сроки идентификации сокращаются при этом на 24–72 часа [3].

Выделение условно-патогенной микрофлоры из патологического материала еще не является доказательством их этиологической роли, так как те же самые микроорганизмы колонизируют влагалище в норме (табл. 1).

Таблица 1

Нормальная микробиота влагалища женщин репродуктивного возраста [составлено по 1, 2]

Встречаются более чем у 50 % женщин

Встречаемость у 10-50 % женщин

Микроорганизмы

Титр, КОЕ/мл

Микроорганизмы

Титр, КОЕ/мл

Lactobacillus spp. в титре

106-109

Esсherichia coli

102-103

Peptostreptococcus spp.

103-104

Gardnerella vaginalis

102-103

Сorynebacterium spp.

103-104

Candida albicans

102-103

Стрептококки группы viridans

103-104

Mycoplasma hominis

102-103

Коагулазонегативные стафилококки

104-105

Ureaplasma urealyticum

102-103

Micrococcus spp.

103-104

Neisseria spp.

103-104

Propionibacterium spp.

103-104

Bifidobacterium spp.

105-106

Porphyromonas spp.

102-103

Actinomyces spp.

102-103

Bacteroides spp.

102-103

Fusobacterium spp.

102-103

Prevotella spp.

102-103

Clostridium spp.

103-104

При исследовании отделяемого влагалища, в норме имеющего разнообразную микробиоту, большое значение придается оценке видового состава, количественной оценке роста различных видов, выросших при первичном посеве, однотипности результатов при повторных исследованиях, а также клиническим данным. Только учет количественных соотношений отдельных видов микроорганизмов в составе микробиоты может характеризовать состояние вагинального микроценоза и степень его нарушения [1, 2, ].

У женщин бактериологическое исследование на факультативно-анаэробную группу и микроаэрофилы отделяемого влагалища позволяет выявить следующие нарушения в микробиоценозе влагалища: неспецифический (аэробный) вагинит, бактериальный вагиноз (G. vaginalis), вульвовагинальный кандидоз, вагиниты, ассоциированные с уреаплазмами и микоплазмами (табл. 2).

Таблица 2

Нарушения в составе микробиоты влагалища у женщин [составлено по 7, 8]

Заболевание

Возбудители

Титр, КОЕ/мл

Аэробный вагинит (АВ)

Энтеробактерии: E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp.

НФБ: P.aeruginosa

Стафилококки: S.aureus

Стрептококки: S.agalactiae

Энтерококки: E.faecalis

> 104

 

≥ 102

≥ 102

≥ 102

≥ 104

Бактериальный вагиноз (БВ)

Полимикробный синдром:

G. vaginalis

Анаэробы: Bacteroides spp.

Prevotella spp.

Peptostreptococcus spp.

Mobiluncus spp.

Atopobium vaginae

 

Микоплазмы: M. hominis

Лактобактерии со сниженными протективными свойствами (L. iners)

Бактериальные биопленки

 

≥ 104

≥ 106

≥ 106

≥ 106

≥ 106

наличие в любом титре

≥ 104

Вульвовагинальный кандидоз

Грибы: C.albicans

Candida non-albicans

≥ 104

≥ 104 КОЕ/мл

Вагиниты, ассоциированные с микоплазмами

Ureaplasma urealyticum

Ureaplasma parvum

M. hominis

≥ 104

≥ 104

≥ 104

Цель исследования. Изучить качественный и количественный состав факультативно-анаэробной и микроаэрофильной микробиоты влагалища женщин репродуктивного возраста с жалобами разного характера, включая воспалительную реакцию во влагалище, при комплексном микробиологическом исследовании с идентификацией микроорганизмов методом время-пролетной масс-спектрометрии.

Материалы и методы исследования

Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 373 пациенток в возрасте от 18 до 45 лет (средний возраст 31,4 ± 0,5 года), обратившихся на консультативный прием с жалобами на гнойные или слизистые выделения, дискомфорт, зуд наружных половых органов, диспареунию. Все пациентки перед исследованием подписывали информированное согласие. Комплексное микробиологическое исследование влагалищного отделяемого включало: микроскопию мазков (окрашенных по Граму) и культуральное исследование отделяемого влагалища. При оценке мазков учитывали количественное и качественное состояние вагинального эпителия, лейкоцитарную реакцию, разнообразие морфотипов бактерий, наличие дрожжеподобных клеток и псевдомицелия, «ключевых» клеток. Для культурального исследования взятие отделяемого влагалища проводили стерильным вискозным тампоном в пробирку с твердой транспортной средой Amies (Италия) с углем. Первичный посев с полуколичественной оценкой роста микроорганизмов проводили на селективные и дифференциально-диагностические питательные среды: 5 % кровяной агар, агар MRS для лактобактерий и агар Сабуро для грибов. Степень микробной обсемененности определяли в пересчете на тампон – КОЕ/т [4]. Все посевы культивировали по стандартной методике при температуре 36 °С в течение 24–48 часов. Культивирование микроаэрофилов осуществляли в СО2 инкубаторе при 5 % концентрации углекислого газа.

Для исследования на облигатные патогены использовали наборы реагентов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» «АмплиСенс N. gonorrhoeae, C. trachomatis, M. genitalium, T. vaginalis Мультипрайм-FL» (ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва) в соответствии с инструкцией производителя. Из исследования были исключены 7 женщин с инфекциями, передающимися половым путем (ИППП), вызванными C. trachomatis, T. vaginalis, M. genitalium.

Идентификация выделенных культур микроорганизмов проводилась на анализаторе VITEK MS (BioMerieux, Франция) методом MALDI – TOF (матричная лазерная время-пролетная масс-спектрометрия) с последующим анализом спектра с помощью базы данных VITEK MS.

Для выявления микоплазм и уреаплазм использовались коммерческие наборы для полуколичественной оценки Mycoplasma IST 2 с определением чувствительности к антибиотикам (BioMerieux, Франция).

Результаты исследования и их обсуждение

При бактериологическом исследовании микробиоты влагалища у пациенток с жалобами разного характера наиболее часто выделялись: лактобактерии (69,9 %), дрожжеподобные грибы рода Candida (19,1 %), грамотрицательные палочки семейства Enterobacteriaceae (18,8 %), грамположительные, факультативно-анаэробные кокки рода Staphylococcus (19,1 %), Streptococcus (13,1 %), Enterococcus (10,4 %), микро-аэрофильные коккобациллы G.vaginalis (13,7 %), грамположительные палочки рода Corynebacterium (3,6 %), грамотрицательные палочки рода Haemophilus (0,5 %). Ureaplasma spp. были обнаружены у 9,3 % пациенток, M. hominis – 3,6 %, ассоциации Ureaplasma spp. и M. hominis – 3,8 %. Среди отдифференцированных видов лактобактерий в микробиоте пациенток (n = 366) доминировали L.crispatus (9 %), L. jensenii (8,2 %), L.gasseri (5,5 %). В меньшей степени встречались L. acidophillus, L. delbrueckii, L. fermentum, L. salivarius, L. rhamnosus. У 52,9 % пациенток лактобактерии выделялись в высоких титрах (107 КОЕ/т), у 16,7 % в низких титрах (105 КОЕ/т), у трети пациенток (30,4 %) рост культивируемых лактобактерий отсутствовал. Доля пациенток, у которых выделялась только нормобиота, составила 41,5 %.

Полная информация о микробиоте влагалища пациенток, идентифицированной методом масс-спектрометрии, представлена в табл. 3.

У 72,7 % из 366 пациенток при микроскопии нативных мазков обнаружена лейкоцитарная реакция (более 10 лейкоцитов в поле зрения). Умеренное количество лейкоцитов в мазках (10–20 в поле зрения) наблюдалось у 19,9 %, большое количество (20–80 в поле зрения) у 41 % и резко выраженная лейкоцитарная реакция более 80 лейкоцитов в поле зрения) – у 11,7 %. Количество лейкоцитов в мазках в пределах нормы (до 10 в поле зрения) отмечено у 27,3 % пациенток.

Анализ результатов показал, что у пациенток с лейкоцитарной реакцией в микробиоте влагалища достоверно чаще выявлялся S. aureus (3,8 %), инфицирование факультативно-анаэробными бактериями (энтеробактерии, St. agalactiae, E. faecalis) с инфекционным индексом 2 (3,8 %), а также L. gasseri (6,8 %), p ≤ 0,05. У 13,5 % пациенток с лейкоцитарной реакцией выделялись, помимо нормальной микробиоты, только дрожжеподобные грибы рода Candida, преимущественно C. albicans. В 3,8 % грибы рода Candida сочетались с другими УПМ в диагностически значимых титрах (E. coli, Kl. pneumoniae, St. agalactiae, St. aureus, E. faecalis, Citrobacter koseri).

Таблица 3

Факультативно-анаэробная и микроаэрофильная микробиота влагалища у женщин репродуктивного возраста с воспалительной реакцией и без нее (n = 366)*

Семейство/род

Микроорганизмы

С лейкоцитарной реакцией

(n = 266)

Без лейкоцитарной реакции

(n = 100)

Всего культур

(n = 366)

абс.

%

абс.

%

абс.

%

Streptococcaceae

р. Streptococcus

Streptococcus agalactiae

20

7,5

7

7,0

27

7,4

Str. anginosus

12

4,5

3

3,0

15

4,1

Str. mitis

1

0,4

1

1,0

2

0,5

Str. salivarius

1

0,4

0

0

1

0,3

Str. vestibuliaris

1

0,4

0

0

1

0,3

Str. infantarius

1

0,4

0

0

1

0,3

Str. galloticus

0

0,0

1

1,0

1

0,3

Всего

36

14,4

12

12,0

48

13,1

р. Enterococcus

Enterococcus faecalis

28

10,5

10

10,0

38

10,4

Micrococcaceae

р. Staphylococcus

St. aureus

10

3,8**

1

1,0

11

3,0

St. hominis

2

0,8

0

0

2

0,5

St. epidermidis

30

11,3

16

16,0

46

12,6

St.lugdunensis

4

1,5

0

0

4

1,1

St. haemolyticus

4

1,5

3

3,0

7

1,9

Всего

50

20

20

20,0

70

19,1

Enterobacteriaceae

Escherichia coli

37

13,9

16

16,0

53

14,5

Enterobacter aerogenes

4

1,5

2

2,0

6

1,6

Enterobacter.cloacаe

0

0,0

1

1,0

1

0,3

Klebsiella pneumoniae

8

3,0

0

0

8

2,2

Citrobacter koseri

1

0,4

0

0

1

0,3

Всего

50

20

19

19,0

69

18,8

Дрожжеподобные грибы

C. albicans

48

18,0

14

14,0

62

16,9

C. tropicalis

0

0,0

1

1,0

1

0,3

С. parapsilosis

0

0,0

1

1,0

1

0,3

C. krusei

1

0,4

0

0

1

0,3

C. dublinensis

2

0,8

0

0

2

0,5

C. glabrata

3

1,1

0

0

3

0,8

Всего

54

21,6

16

16,0

70

19,1

р. Corynebacterium

C. spp.

5

1,9

3

3,0

8

2,2

C. gluconorolyticum

1

0,4

0

0

1

0,3

C. amycolatum

0

0,0

2

2,0

2

0,5

C. aurimucorum

1

0,4

0

0

1

0,3

C. coyleae

1

0,4

0

0

1

0,3

Всего

8

3,2

5

2

13

3,6

р. Haemophilus

H. influenzae

1

0,4

0

0

1

0,3

H. haemolyticus

1

0,4

0

0

1

0,3

Всего

2

0,8

0

0

2

0,5

Gardnrella

G. vaginalis

38

14,3

12

12,0

50

13,7

Lactobacillus

Lactobacillus spp.

104

39,1

46

46,0

150

41,0

L. acidophillus

8

3,0

3

3,0

11

3,0

L. crispatus

26

9,8

7

7,0

33

9,0

L. delbrueckii

4

1,5

1

1,0

5

1,4

L. fermentum

2

0,8

0

0

2

0,5

L. gasseri

18

6,8**

2

2,0

20

5,5

L. jensenii

21

7,9

9

9,0

30

8,2

L. salivarius

4

1,5

0

0

4

1,1

L. rhamnosus

0

0,0

1

1,0

1

0,3

Всего

187

74,8

69

69,0

256

69,9

Микст-инфицирование

Факультативно-анаэробные микроорганизмы (х2)

10

3,8**

1

1,0

11

3,0

Факультативно-анаэробные/Грибы

10

3,8

12

12,0

22

6,0

Факультативно-анаэробные/Микроаэрофилы

3

1,1

4

4,0

7

1,9

Микроаэрофилы/ Грибы

8

3,0

1

1,0

9

2,4

Ассоциации с Ureaplasma spp.

22

8,3

5

5,0

27

7,4

Ассоциации с Ureaplasma spp./ Mycoplasma hominis

8

3,0

4

4,0

12

3,3

Всего

61

22,9

27

27,0

88

24,0

Примечание. * – поливариантный признак; ** – различия между группами пациенток с лейкоцитарной реакцией и без нее, p ≤ 0,05.

В 3,0 % случаев имело место микст-инфицирование влагалища грибами рода Candida и G. vaginalis. У 9,0 % женщин выделялась G. vaginalis в высоких титрах, причем в двух случаях обнаруживались также Corynebacterium aurimucorum и Corynebacterium simylans в высоких титрах, в трех случаях – St. anginosus. В трех случаях (1,1 %) наблюдалось микст-инфицирование влагалища G.vaginalis и E. coli. У 11,3 % пациенток в ассоциациях с факультативно-анаэробными микроорганизмами участвовали Ureaplasma spp. и M. hominis. Наиболее часто (31,6 %) у пациенток с лейкоцитарной реакцией в диагностически значимых титрах (более 104 КОЕ/т) в монокультуре выделялись микроорганизмы семейства Enterobacteriaceae: E. coli (у 9,4 %), Kl. pneumoniae (1,5 %), реже Enterobacter aerogenes (0,4 %), а также представители семейства Streptococcaceae: St. agalactiae (5,3 %) и E. faecalis (7,9 %). У 52,5 % пациенток с выраженной лейкоцитарной реакцией условно-патогенные микроорганизмы выделялись в титрах 104–107 КОЕ/т, у 41,5 % пациенток – в высоких титрах 108–109 КОЕ/т. Дрожжеподобные грибы рода Candida в 1,4 раза чаще встречались в группе пациенток с лейкоцитарной реакцией (21,6 %). C. krusei, C. dublinensis, C. glabrata выделялись только в этой группе.

Среди пациенток без лейкоцитарной реакции доля женщин с нормобиотой составила 51,0 % (достоверно выше, чем в группе с лейкоцитарной реакцией, p ≤ 0,05). У пациенток без лейкоцитарной реакции (менее 10 лейкоцитов в поле зрения) в половых путях часто выделялись в титре более 104 КОЕ/т дрожжеподобные грибы рода Candida (16 %), при этом обычно в ассоциациях с другими условно-патогенными возбудителями (в 13 %): E. coli, St. agalactiae, E. faecalis, G. vaginalis, S. aureus.

У 30,4 % пациенток, у которых отсутствовал рост лактобактерий, нормобиота замещалась в 10,9 % G. vaginalis, в 7,7 % – энтеробактериями, в 4,9 % – дрожжеподобными грибами рода Candida, реже S. agalactiae (2,5 %), E. faecalis (3,0 %) и S. aureus (1,4 %).

Заключение

Задачей культурального исследования является не только идентификация микроорганизмов, обнаруженных в клиническом материале, но и обоснование их этиологической роли в воспалительном процессе у данного больного. При этом важна объективная и комплексная оценка микроскопии клинического материала, результатов прямого посева на плотные питательные среды, клинико-анамнестических данных (рисунок).

evast.tiff

Алгоритм микробиологического исследования отделяемого влагалища у женщин

Метод, основанный на масс-спектрометрическом профилировании рибосомальных белков микроорганизмов, позволил провести довидовую идентификацию культивируемых лактобактерий, коринебактерий, стрептококков группы viridans (всего 108 культур), которые обычно в рутинной практике лабораторий идентифицируются только до рода. Встречаемость микробных ассоциаций из 2 условно-патогенных агентов, идентифицированных до вида, наблюдалась почти у каждой четвертой пациентки с воспалительным процессом урогенитального тракта. Это, в свою очередь, необходимо для накопления знаний и лучшего понимания роли условно-патогенных микроорганизмов в патологии урогенитального тракта.

Видовая идентификация культивируемых лактобактерий методом масс-спектрометрии позволила установить, что наиболее часто в составе микробиоты влагалища встречаются L. crispatus, L. jensenii и L. gasseri. Наши данные и другие проведенные исследования опровергают ранее существовавшее мнение о доминирующем положении L.acidophilus в видовом составе влагалищных лактобактерий [3, 5, 6, 9]. Это связано с тем, что фенотипические характеристики L. acidophilus и тесно связанных с ними 6 видов лактобактерий оказались весьма ненадежными [5]. Следует отметить, что у 30,4 % женщин отсутствовали культивируемые на MRS агаре лактобактерии, которые обеспечивают колонизационную резистентность влагалища и препятствуют чрезмерному размножению и транслокации условно-патогенных микроорганизмов. В то же время у 62,0 % пациенток (n = 366) с сохранной нормобиотой наблюдалась воспалительная реакция в половых путях и повышенные титры УПМ, что говорит о значительной роли местной иммунологической резистентности.


Библиографическая ссылка

Евстигнеева Н.П., Аминева П.Г., Герасимова Н.А., Зильберберг Н.В., Кунгуров Н.В. МИКРОБИОТА УРОГЕНИТАЛЬНОГО ТРАКТА ПАЦИЕНТОК РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА, ИДЕНТИФИЦИРОВАННАЯ НА ОСНОВЕ МАСС-СПЕКТРОВ РИБОСОМАЛЬНЫХ БЕЛКОВ // Успехи современного естествознания. – 2015. – № 2. – С. 34-39;
URL: http://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=34696 (дата обращения: 20.07.2019).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.252