Цель: В последние годы получило развитие новое научное направление исследований, связанное с изучением факторов гуморального иммунитета - естественных антител (е-ат), которые продуцируются В-клетками в норме в отсутствие антигенной стимуляции. К настоящему времени изучены основные свойства этих антител и их отличие от антител, полученных активной иммунизацией. Так известно, что они связываются с эндогенными биорегуляторами и участвуют в регуляции гомеостаза, являются низко аффинными полиспецифическими иммуноглобулинами и существуют в виде иммунных комплексов, осуществляя транспортную функцию. Исследованиями последних лет установлено, что естественные антитела изменяют свои свойства (аффинность, специфичность) при развитии патологии и их содержание может коррелировать с течением заболевания. Вот почему разработка методов определения е-ат является актуальной задачей для выбора новых критериев диагностики и прогноза заболеваний.
Оксид азота - NO является основным вазодилятирующим фактором, препятствующим тоническому сокращению сосудов. NO образуется под действием фермента NO-синтазы путем окисления терминального атома азота гуанидина в L-аргинине. NO-синтаза существует в виде трех изоформ, выполняющих указанную выше функцию, но имеющих отличие в аминокислотной последовательности. Целью настоящей работы явилась разработка метода определения уровня е-ат к эндотелиальной NO-синтазе (e-NOS), которая относится к конституциональным ферментам и стабильно экспрессируется в эндотелиальных клетках. Инсулин способствует вазодилятации за счет активации синтеза NO клетками эндотелия. При инсулинорезистентности, характерной для сахарного диабета 2-ого типа, показано уменьшение инсулин-опосредованной и эндотелий-зависимой вазодилятации. Результаты различных исследований свидетельствуют о том, что сахарный диабет (СД) сопровождается дисфункцией эндотелия, который при этом теряет способность к адекватному синтезу вазодилятаторов. Нарушение соотношения вазоактивных факторов играет важную в развитии диабетической нефро- и полинейропатии. Кроме того, изменение ауторегуляции сосудов сетчатки приводит к развитию диабетической ретинопатии.
Методы исследования: Больным проводили стандартное офтальмологическое обследование, флуоресцентная ангиография глазного дна. Определение уровня е-ат к эндотельальной NO-синтазе в сыворотке крови и слезе выполняли иммуноферментным методом анализа.
Разработка метода выявления уровня е-ат основана на процедуре гетерогенного иммуноферментного анализа (ИФА). На полистирольных планшетах сорбировали специфический антиген (Аг), полученный методом активированных эфиров с использованием полимерной матрицы 4-полинитрофенилакрилата. Этот способ синтеза позволил максимально сохранить структуру исходного соединения - С-концевого пептида эндотелиальной NO-синтазы. Данный 20-членный пептид является уникальным отличительным признаком е-NOS от других изоформ этого фермента. Уровень е-Ат определяли по изменению оптической плотности (OD492) в ИФА. Была исследована зависимость изменения оптической плотности от концентрации иммобилизованного Аг и степени разведения сыворотки и слезы. Обнаруженные е-Ат относились к иммуноглобулинам класса М.
Математическая обработка полученных данных проводилась с помощью специальной программы.
Результаты: Было обследовано 49 человек (98 глаз). Среди больных диабетической ретинопатией (ДР) выделена группа больных с пролиферативной диабетической ретинопатией (ПДР) - 25 человек, с препролиферативной диабетической ретинопатией (Пре ПДР) - 5 человек, группа больных с другими глазными заболеваниями без сахарного диабета - 10 человек, и группа здоровых лиц - 9 человек. Группы были сопоставимы по полу и возрасту.
Таблица 1. Результаты определения уровня е-ат к е-NOS методом ИФА
|
Группа |
Количество человек (глаз) |
Среднее значение OD492 (М±d) |
|
|
В крови |
В слезе |
||
|
ПДР |
25 (50) |
0,40+0,16 |
0,8+0,36 |
|
ПреПДР |
5(10) |
0,43+0,14 |
0,88+0,37 |
|
Другие заболевания |
10(20) |
0,45+0,2 |
0,67+0,24 |
|
Доноры |
9(18) |
0,3+0,1 |
0,76+0,35 |
При анализе множественного критерия Шиффа не обнаружена достоверная разница в группах больных с диабетической ретинопатией (ДР) и нормальными донорами. Статистически значимая разница по уровню е-Ат к e-NOS в крови ( р=0,04) выявлена только между группой лиц с другими глазными заболеваниями и группой доноров. Далее для поиска дифференциального диагностического критерия больные с диабетической ретинопатией были разделены на группы в зависимости от особенностей течения ДР - наличия и степени выраженности неоваскуляризации, глиоза, макулярных изменений, геморрагической активности, отложений экссудата, проведения лазеркоагуляции. Однако статистически значимой разницы между группами по уровню е-Ат к e-NOS в крови и слезе выявлено не было.
На следующем этапе работы больные с ДР были разделены на группы в зависимости от особенностей течения сахарного диабета (СД). Была выявлена статистически значимая разница (р <0,05) по уровню е-Ат к e-NOS в крови в зависимости от тяжести заболевания и его компенсации СД.
Таблица 2. Результаты ИФА е-ат к е-NOS у больных сахарным диабетом
|
Тяжесть течения СД |
Легкое течение |
Средней тяжести |
Тяжелое течение |
|
Уровень е-Ат к e-NOS в крови (М±d) |
0,12+0,05 |
0,38+0,1 |
0,5+0,2 |
|
Степень компенсации СД |
Компенсированный |
Субкомпенсированный |
Декомпенсированный |
|
Уровень е-Ат к e-NOS в крови |
0,38+0,11 |
0,4+0,12 |
0,63+0,3 |
Как видно из представленных в таблице данных при легком и компенсированном СД наблюдается наименьшее отклонение в уровне е-ат к е-NOS по сравнению с нормой. Этот факт является косвенным отражением нарушений в организме при СД.
При анализе диабетических осложнений выявлялась статистически значимая разница по уровню е-Ат к e-NOS в крови (р=0,0004) в зависимости от наличия (0,53+0,2) или отсутствия (0,37+0,1) синдрома диабетической стопы.
При анализе типа лечения выявлена статистически значимая разница по уровню е-Ат к e-NOS в слезе (р=0,02) в группе больных с инсулинопотребным СД (0,67+0,32) по сравнению с инсулиннепотребным СД (0,9+0,36).
Выявлялась статистически значимая разница по уровню е-Ат к e-NOS в слезе в зависимости от приема нитропрепаратов (р=0,03) - у лиц не принимавших нитропрепараты уровень е-Ат к e-NOS в слезе был выше(0,42+0,16), чем у принимавших(0,34+0,11).
При построении регрессионной модели было выявлено, что наиболее значимо на уровень е-Ат к e-NOS в крови у больных СД влияли возраст, тяжесть, компенсация и длительность СД, прием нитропрепаратов, наличие экссудаций и геморрагий на глазном дне. Ошибка уравнения =0,089.
На уровень е-Ат e-NOS в слезе наиболее значимо влияют степень тяжести и компенсация СД, тип СД, инсулинопотребность, наличие диабетических осложнений. Ошибка уравнения=0,12.
Выводы
Впервые разработан метод ИФА выявления е-ат к е-NOS в крови и слезе человека. Одновременное определение уровня е-Ат к e-NOS в крови и слезе у больных СД с ДР показало отличие в их содержании по сравнению с нормой. Было выявлено, что уровень е-Ат к e-NOS в слезе в 2-3 раза выше, чем к крови. Были обнаружены изменения уровня е-Ат к e-NOS в завимости от характера течения СД и наличия диабетических осложнений.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Мягкова М.А. // Естественные антитела к низкомолекулярным соединениям. М, 2001г.
- А.В.Погожева, М.А. Мягкова // Питание и естественные антитела в кардиологии, М,2001
- О.Н. Бондаренко, Г.Р. Галстян, М.Б. Анциферов и др. // Биологическая роль оксида азота при сахарном диабете. Сахарный диабет, М, №2, 2002 г.
- В.С. Задионченко, Т.В. Адашева, А.П. Сандомирская. // Дисфункция эндотелия и артериальная гипертония: терапевтические возможности. - Русский медицинский журнал. 2002. - том 10. - № 1. - с.145.