Scientific journal

Advances in current natural sciences

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

Некультивируемыми принято считать бактерии, которые под влиянием различных физико-химических или биологических факторов обратимо утрачивают способность расти на традиционных питательных средах. В настоящее время известно, что 1) переходить в некультивируемую форму (НФ) способны многие виды бактерий, в том числе и возбудители особо опасных инфекций: чумы [11], туляремии [9], холеры [13], 2) в некультивируемом состоянии (НС) клетки сохраняют вирулентность и способны к реверсии [12,15], 3) предполагается, что в НС возбудители различных заболеваний переживают неблагоприятные условия окружающей среды, являясь потенциальным источником заражения [4,13]. Биологические свойства НФ, в том числе и холерных вибрионов, изучены недостаточно. В доступной литературе отсутствуют сведения об особенностях обменных процессов в некультивируемых клетках, в том числе и холерных вибрионов. Между тем они представляет большой научно-практический интерес, так как являются ключевыми для понимания механизмов образования НФ и их выживания в неблагоприятных условиях внешней среды.

Целью настоящей работы является обнаружение функционирования основных энергетических и биосинтетических путей в некультивируемых клетках холерных вибрионов. Для этого изучен катаболизм меченой глюкозы в реакциях цикла Кребса и активность ключевого фермента цикла Кальвина - рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы (РДФК).

Материалы и методы

Для работы использованы три штамма холерных вибрионов: Vibrio cholerae О1 17551, 17558 и V. cholerae О139 17673. По морфологическим, культуральным и биохимическим признакам культуры были типичными. Для получения НФ вибрионы в течение трех часов выращивали на 0,3% агаре Мартена, рН 7,6 с последующим пересевом на 2% агар Мартена, рН 7,7-7,8. Через 18 часов, в зависимости от целей эксперимента, агаровую культуру суспендировали в морской воде, 0,85% растворе NaCl, 1мМ растворе янтарной кислоты, 0,001% растворе витамина Е, 1мМ растворе каталазы или дистиллированной воде. В стеклянных флаконах емкостью 100 мл объем микробной взвеси доводили до 70 мл средой суспендирования и конечной концентрации 109 м.кл/мл. Приготовленные таким образом микрокосмы помещали при + 4оС без освещения. О динамике перехода в НС судили по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) на агаре, для чего каждые 5-7 дней из флаконов с дистиллированной водой и 14 дней из остальных делали высевы. Некультивируемыми считали пробы, в которых высевы на агар не выявляли растущих клеток, но витальным окрашиванием акридиновым оранжевым (разведение 1:5000) обнаруживали подвижные вибрионы, окрашенные в зеленый цвет. В переходных пробах часть клеток (102 - 105 м.кл/мл) еще сохраняла способность расти на питательных средах .

Пути диссимиляции глюкозы изучали радиореспирометрическим методом [16]. В опытах использовали 1С14-, 2С14 -, 6С14 -, 1,6С14 - глюкозу, а также 1.4C14 - янтарную кислоту фирмы «Изотоп». Реакционная смесь объемом 5 мл содержала 5×109 м.кл/мл, суспендированных в 0,85% NaCl, 15 мМ глюкозы-носителя, 0,8 мккюри радиоактивной глюкозы, 60 мМ фосфатного буфера рН 7,8. Выделенную в процессе дыхания углекислоту улавливали 5 N NaOH. Инкубацию проводили в течение трех и семнадцати часов при 37оС. «Ловушки» помещали в 96о этиловый спирт, который затем переносили в сцинтилляционную жидкость. Радиоактивность исследуемых проб измеряли счетчиком Mark II (Searle, USA). Результаты выражали в имп/мин.

Для определение активности РДФК культуру концентрировали центрифугированием при 10000 g 15 мин. Клетки разрушали растиранием с песком, отмывали фосфатным буфером, рН 7,6. Реакционная смесь содержала 18мМ Трис-НСl, pH 8.0, 20мM MgCl2 × 6H2O , 10мM дитиотреитола, 4мМ рибозо - 5 - дифосфата и 500 мкл суспензии разрушенных клеток. Смесь инкубировали 30 мин при 30оС для превращения рибозо-5-фосфата в рибулозо-5-дифосфат под действием эндогенной фосфорибоизомеразы. В реакционную смесь добавляли 0,026мМ NaHC14 O3 , 6мМ АТФ, 0,6 мМ НАДН и инкубировали 5 мин. Реакцию останавливали 0,02 мл 100% трихлоруксусной кислотой. Центрифугировали 30 мин при 8000g, 200 мкл супернатанта помещали в 5 мл сцинтилляционной жидкости. Радиоактивность измеряли счетчиком Mark II. Активность фермента выражали в имп/мин.

Результаты и обсуждение

Углеводы являются важным источником энергии и углерода для микроорганизмов. Утилизация энергии углеводов клеткой происходит в цепи последовательных реакций фосфорилирования промежуточных продуктов, дегидрирования, переноса электронов на кислород или другие акцепторы. Механизм диссимиляции различных сахаров отражает не существование какого-либо специфического пути их распада, а лишь способность микроорганизма к синтезу некоторых ферментов, катализирующих превращение конкретных субстратов [5]. Поэтому изучение процессов диссимиляции глюкозы у НФ вибрионов позволяет судить о катаболизме углеводов в целом.

К настоящему времени известно три пути диссимиляции углеводов до С3-соединений и пирувата. Это гликолиз (или путь Эмбдена - Мейергофа - Парнаса), гексозомонофосфатный путь (пентозофосфатный цикл) и, встречающийся только у некоторых бактерий, путь Энтнера - Дудорова. Гликолиз и гексозомонофосфатный шунт функционируют у холерных вибрионов одновременно, обеспечивая клетку энергией и компонентами синтеза белков, жиров, нуклеиновых кислот. По гликолитическому пути расщепляется 89-93% глюкозы, а на долю гексозомонофосфатного шунта приходится 7-11% [1].

Установить метаболические пути, в которые вовлекается углевод, позволяет сопоставление количественного выхода радиоактивного СО2 в процессе распада 1С14 - и 6С14- глюкозы. Известно, что включение радиоактивных меток в углекислоту наблюдается при распаде 1С14 -- глюкозы по гексозо-монофосфатному пути (ГМФП). Точкой образования радиоактивного СО2 является реакция декарбоксилирования 6-фосфоглюконата, образующегося из глюкозо-6-фосфата. Использование в опыте 6С14 - глюкозы приводит к тому, что это атом, также как и первый (в отличие от остальных атомов) при распаде карбогидрата по пути Эмбдена-Мейергофа попадает в метильную группу пирувата, и при дальнейшем метаболизме в цикле Кребса судьба шестого атома углерода аналогична судьбе первого. Однако при распаде 6С14- глюкозы по ГМФП включение метки в СО2 на происходит, так как при декарбоксилировании 6-фосфоглюконата шестой углеродный атом переходит в состав рибулозо-5-фосфата. Обычно одинаковая радиоактивность СО2 наблюдается при диссимиляции 1С14 - и 6С14- глюкозы и указывает на расщепление молекул карбогидрата по пути Эбдена-Мейергофа (гликолиза) с последующей утилизацией продуктов распада в цикле Кребса (цикле ди- и трикарбоновых кислот).

Результаты изучения путей диссимиляции глюкозы исходных, переходных и НФ холерных вибрионов с использованием глюкозы, меченой по первому или шестому атомам, представлены в Таблице 1. Изучение динамики изменений катаболизма глюкозы в клетках холерных вибрионов, пребывающих в микрокосмах, показало, что в популяциях, в которых 102- 103 м.кл/мл сохраняют способность расти на агаре Мартена, наблюдаются значительные изменения утилизации углеводов. Также как и в исходных культурах, в переходных и НФ уровень радиоактивности СО2, выделенного в результате катаболизма глюкозы, меченой по первому и шестому атомам, был приблизительно равным.

Таблица 1.

Радиоактивность выделенного СО2 при диссимиляции глюкозы некультивируемыми штаммами V.cholerae eltor и их исходными вариантами (2 часа инкубации)

Также как и в исходных культурах, в переходных и НФ уровень радиоактивности СО2, выделенного в результате катаболизма глюкозы, меченой по первому и шестому атомам, был приблизительно равным. Однако уровень радиоактивности переходных и некультивируемых проб после двух часов инкубации был значительно ниже, чем у исходных вариантов. Выделение радиоактивного углекислого газа пропорционально длительности пребывания в микрокосмах. Через два часа инкубации остаточный уровень радиоактивности обнаружен в трехдневных некультивируемых пробах, в то время как в четырнадцатидневных и более старых радиоактивный респираторный СО2 не обнаружен.

Увеличение времени инкубации с радиоактивной меткой до 17-18 часов в наших опытах привело к увеличению выхода меченого СО2 и позволило обнаружить его у 14-дневных НФ (Таблица 2).

Таблица 2

Радиоактивность СО2, выделенного при диссимиляции 1С14-глюкозы исходными и НФ холерных вибрионов при разном времени инкубации

Выделение углекислоты в результате утилизации 1С14-глюкозы по сравнению с исходными культурами в НФ снизилось до 1,5% - 0,3% у трехдневных и четырнадцатидневных вариантов соответственно. В переходных пробах этот показатель составил 10,4%. Увеличение времени инкубации до 17 часов позволило обнаружить остаточный уровень радиоактивности и в 25-дневных пробах. Согласно данным литературы [7], суммарная скорость образования респираторного СО2 из атома 1С14-глюкозы, прямо характеризует скорость катаболизма по пентозофосфтному пути. Однако в системе гликолиз - цикл Кребса также может происходить эта реакция. Но превращение атома С1 в СО2 по пентозофосфатному пути является быстрым процессом (включает три ферментативных стадии), в то время, как соответствующие превращения в системе гликолиз - цикл Кребса предполагает прохождение всех реакций гликолиза и более чем однократного прохождения ферментативных реакций цикла Кребса, что ведет к замедленному выходу радиоактивного СО2.

С целью обнаружения функционирования цикла Кребса в НФ использовали 2С14-глюкозу и 1,4С14-янтарную кислоту. Известно, что второй углеродный атом глюкозы при превращении ее по пути Эмбдена-Мейергофа попадает в карбоксильную группу ацетата и выделяется в виде радиоактивной углекислоты при диссимиляции в цикле Кребса на уровне α-кетоглутарата на втором обороте цикла. Также как и при использовании глюкозы, меченой по первому и шестому атомам, выход радиоактивного углекислого газа в НФ значительно ниже, чем в исходных культурах. В результате утилизации 2С14-глюкозы он составил 20,2% от исходного, а 1,4С14-янтарной кислоты - 19% процентов Обнаружено, что 2С14- глюкоза включается в СО2 у четырнадцатидневных НФ, в то время, как 6С14-глюкоза не приводит к выходу радиоактивной углекислоты. Можно предположить, что у НФ холерного вибриона функционирует фрагмент цикла Кребса, где включается карбоксильная группа ацетата. Подтверждением этому предположению является включение 1,4С14 - янтарной кислоты, первый меченый атом которой превращается в 5-й углерод лимонной кислоты с последующим декарбоксилированием на уровне α-кетоглутарата, что приводит к выделению радиоактивного углекислого газа уже на первом обороте цикла. (Таблица 3).

Из данных литературы известно, что у некоторых гетеротрофов, например у E. coli [3], Y. pestis [10] может функционировать цикл Кребса, но в разорванном виде, таким образом, что одна часть реакций осуществляется от лимонной кислоты до α-кетоглутаровой, а вторая в обратном направлении - от щевелевоуксусной к янтарной. Запускается такая система реакций на основе метаболитов, получаемых в цикле Кальвина. Эти данные, а также сведения о функционировании цикла Кальвина в вибрионах, длительно пребывающих в морской воде [2] послужили основанием для попытки его выявления в НФ.

Таблица 3.

Радиоактивность СО2 (% от добавленной радиоактивности) при диссимиляции добавленного субстрата исходными и некультивируемыми клетками холерных вибрионов через 2 часа инкубации

С этой целью проведена серия опытов по определению активности одного из двух ключевых ферментов цикла Кальвина - рибулозодифосфаткарбоксилазы (РДФК), систематическое название 3-фосфо-D-глицерат-карбоксилаза димеризующая. Синтез этого энзима клетками свидетельствует о функционировании пентозофосфатного цикла [6]. Указанный фермент катализирует фиксацию СО2 в результате чего образуется первичный стабильный продукт реакции - 3-фосфоглицерат. Функционирование цикла Кальвина обеспечивает клетку гексозами, пентозами для синтеза нуклеиновых кислот, фосфоглицериновым альдегидом, из которого в дальнейшем синтезируется пировиноградная кислота, используемая для образования аминокислот, липидов и других компонентов клетки.

Обнаружено (Таблица 4), что в двухмесячных НФ холерных вибрионов активно функционирует РДФК.

Таблица 4.

Активность рибулозодифосфаткарбоксилазы исходных, переходных и НФ хлерных вибрионов

Различий в активности фермента между штаммами не выявлено как у исходных, так и у переходных и НФ. Активность фермента в исходных пробах была на фоновом уровне. Существенные различия получены в пробах из микрокосмов с разным составом. Максимальная активность обнаружена в некультивируемой пробе с добавлением 1мМ янтарной кислоты. Несколько более низкие, но превышающие исходный уровень в 5,4-4,6 раз, значения получены для переходных вариантов в микрокосмах с морской водой. Минимальные значения активности обнаружены в микрокосмах, где в качестве антиоксиданта добавлен витамин Е. Таким образом, проведенные исследования позволяют заключить: Изменения в диссимиляции глюкозы происходят еще до утраты клетками способности образовывать колонии на питательных средах. Уменьшение количества и замедление выхода радиоактивного углекислого газа в НФ холерных вибрионов, вероятно, связано с перестройкой метаболизма, проявляющемся в сдвиге его в сторону гликолиза и разрывом цепей цикла Кребса, характерным для хемолитоавтотрофов.

Пребывание в условиях микрокосмов при низкой температуре индуцирует функционирования цикла Кальвина, что вероятно, обеспечивает клетку необходимыми пластическими материалами и способствует выживанию при отсутствии органических питательных веществ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алексеева Л.П. Пути диссимиляции глюкозы, манозы и глюконата у неагглютинирующихся и Эль-Тор вибрионов. Автореф. дисс. ... канд. биол. наук. - Ростов-на-Дону, 1975.
2. Бурша О.С., Каграманов В.С., Соколенко А.В. Определение активности рибулозодифосфаткарбоксилазы у инактивных вариантов Vibrio cholerae eltor. // Журн. микробиол., эпидемиоло. и иммунобиол. - 1999. - № 6.- С. 90.
3. Вершигора А.Е. Общая микробиология. - Киев, «Выща школа». 1988 -342с.
4. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. Некультивируемые формы бактерий и их роль в сохранении возбудителей сапронозов во внешней среде. // Журн. микробиол., эпидемол. и иммунобиол. - 1997. - №3. - С.116.
5. Голубинский Е.П. Дыхательный аппарат и окислительный метаболизм чумного микроба. Автореф. дис. ... док. мед. наук.Саратов, 1974..
6. Готшалк Г. Метаболизм бактерий. М., «Мир», 1982, 310с.
7. Доис Э. Количественные проблемы биохимии. М., «Мир», 1983 373с.
8. Ломов Ю.М., Асеева Л.Е., Каграманов В.С. Диссимиляция глюкозы штаммами Л-форм холерных вибрионов. //Микробиол. журн. -1983. -Т.45. -№3. - С.42.
9. Пичурина Н.Л. Эпидемиологические аспекты туляремии и совершенствование методов лабораторной диагностики (на примере Ростовской области). Автореф. дисс. ...канд.мед.наук - Саратов - 1999.
10. Рублев Б.Д. Пути обмена глюкозы и глюконата и окислительное фосфорилирование у чумного микроба. Автореф. дисс.... канд. мед. наук , Ростов-на-Дону, 1972.
11. Сучков Ю.Г., Худяков И.В., Емельяненко Е.Н. и др. О возможности сохранения возбудителя чумы в почве в покоящейся форме (некультивируемой форме). // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1997. -№4. -С.42.
12. Colwell R.R. Nonculturable but still viable and potentially pathogenic . //
13. Int. J. Med. Microbiol.Virol.Parasitol.Infect.Dis. - 1993. -v.279. - N2. -p.154.
14. Colwell R.R. Global climate and infections diseas: the cholera paradigm. //Scienc.- 1996.- V.274. -Dec.20.-P.2025
15. Colwell R.R., Bryton P. R., Grimes D.J. et.al. Viable but nonculturable Vibrio cholerae and related pahtogenes in the environment: implication for the releas of genetically engineered microorganisms. // Bio/ Technology. - 1985. -V.3. -P.817.
16. Nilsson L., Oliver J.D., Kjelleberg S. Resuscitation of Vibrio vulnificus from the viable but nonculturable state // J. Bacteriol., -1991.- V.173., -N16,- P.5054.
17. Wang C.H., Stern J., Gilmour C.M. et.al. Comparativ study of glucose catabolism by radiorespirometrie method . // J. Bacteriol. - 1958. -V.76. -N1. - P.207.