Известно, что химические соединения с предполагаемыми терапевтическими свойствами обязательно проходят этап их физиологического изучения на животных с целью определения общих свойств и механизма действия [3]. К таким веществам можно отнести производные 1,5-бензодиазепинона-2, которые недавно были получены в результате целенаправленного синтеза [1] и естественно, существует потребность в изучении их биологической активности. Так как 1,5-бензодиазепинон-2 и его новые производные являются структурными гомологами 1,4-бензодиазепина, то естественно, следует ожидать, что они могутобладатьпсихотропными свойствами.
Целью настоящей работы было выяснение наличия, направленности и выраженности психотропных свойств1,5-бензодиазепинона-2 и его новых производных, и сопоставить их эффекты с таковыми терапевтической дозы диазепама.
Материалы и методы исследования
Исследование психотропныхэффектов1,5-бензодиазепинона-2 (БД1) и его трех производных (4-метил-1,5-бензодиазепинона-2 (БД2), 3-метил-1,5-бензодиазепинона-2 (БД3) и 5-формил-3-метил-1,5-бензодиазепинона-2 (БД4) было проведено на 60 белых беспородных крысах-самцах массой 180–220 г, которые были разделены на 6 групп по 10 особей в каждой. За 30 мин до тестирования одной группе вводили физиологический раствор (контроль), другой – диазепам (препарат сравнения) в дозе 5 мг/кг и четырем – тестируемые вещества в одной из следующих доз 5, 25, 50 и 100 мг/кг, которые растворяли в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно. Объем вводимого раствора составлял 0,2 мл.
Изучение психотропной активности проводили вэкспериментальных тестах-моделях: «открытое поле» [6], «черно-белая камера»[5], «подвешивание за хвост» [8] и тест Порсолта [10].
Полученные результаты сравнивались с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Для наглядного предоставления результатов использовали условные единицы (%).
При выполнении экспериментов соблюдали нормы и принципы, утверждённые Постановлением первого национального конгресса по биоэтике (Киев, 2001) и Законом Украины «О защите животных от жестокого обращения» от 21.02.2006, с изменениями от 15.12.2009.
Проведение исследований одобрено и комитетом по биоэтике ТНУ им. В.И. Вернадского (протокол № 3 от 20.09.2012 г.).
Результаты исследования и их обсуждение
Результаты теста «открытое поле». Диазепам в дозе 5 мг/кг по сравнению с контролем увеличивал (на 130,1 %) уровень исследовательской активности (ИА), что указывает на снижение тревожности, и расценивается [6] как проявление анксиолитических свойств, а показатели горизонтальная двигательная активность (ГДА), вертикальная двигательная активность (ВДА), груминг (Гр) и дефекация (Деф), наоборот, угнетал на 55,0; 91,2; 58,9 и 56,2 % соответственно, что согласно [3] указывает напроявление седативных свойств (на рис. 1 показатели ВДА и Гр не отражены).
Рис. 1. Влияние 1,5-бензодиазепинона-2и его трех производных (в указанных под гистограммами дозах (мг/кг)) на поведение крыс в тесте «открытое поле». Примечание:* – р ≤ 0,05; ** – p ≤ 0,01; *** − р ≤ 0,001, где р − уровень достоверности по отношению к контролю, обозначенный жирной линией (100%). ИА – исследовательская активность, ГДА – горизонтальная двигательная активность, Деф – дефекация
После введения крысам БД1 в дозах 5 и 100 мг/кг наблюдалось увеличение уровня ИА на 77,6 и 298,0 % соответственно по сравнению с контролем. При этом, в дозе 100 мг/кг уровень ИА превосходил таковой при действии диазепама в 1,7 раза (см. рис. 1, а). Из рис. 1, а также видно, что в дозе 100 мг/кг БД1 увеличивал по отношению к контролю ГДА на 20,0 %, что свидетельствует о проявлении антистрессорного действия, а в дозах 25 и 50 мг/кг наблюдалось увеличение количества Деф на 84,6 и 53,8 % соответственно, что согласно [2], расценивается как развитие стресса. Кроме того следует отметить, что БД1 и его производные в этом тесте подавляли ВДА и Гр во всех исследованных дозах (на рис. 1 они не показаны).
БД2 во всех исследованных дозах по сравнению с контролем увеличивал уровень ИА, которыйне превосходил таковой при действии диазепама (рис. 1, б). Показатель ГДА в дозе 5 мг/кг по сравнению с контролем увеличивался, что указывает на проявление антистрессорного действия вещества, а при дозах 25, 50 и 100 мг/кг, наоборот, снижался, что указывает на его седативное действие на поведение крыс. Следует отметить, что БД2в дозах 5 и 25 мг/кг увеличивал в 2,3 и 2,5 раза уровень Деф (рис. 1, б), что согласно [2] свидетельствует о повышении уровня эмоциональности крыс.
БД3 в дозах 5, 50 и 100 мг/кг по сравнению с контролем увеличивал уровень ИА (на 78,6; 172,0 и 224 % соответственно), при этом в дозах 50 и 100 мг/кг превосходил таковой при действии диазепама (см. рис. 1, в). Показатель ГДА при действииБД3 в дозе 5 мг/кг увеличивался, что указывает на проявление антистрессорного действия данного вещества, а в дозах 25, 50 и 100 мг/кг, наоборот, снижался, что указывает на его седативное действие. Показатели Деф в дозах 5, 25 и 100 мг/кг были выше контроля на 38,5; 238,4 и 53,8 % соответственно, что свидетельствует о развитии стресса [2].
Выявлено, что БД4 во всех исследованных дозах угнетал показатели ИА и ГДА (см. рис. 1, г), а показатель Деф в дозах 50 и 100 мг/кг, наоборот, увеличивался [2, 3, 6], что указывает на развитие стресса. Эти данные свидетельствуют о выраженном анксиогенном действии вещества.
Таким образом, БД1(в дозах 5 и 100 мг/кг), БД2 (в дозах 5, 50 и 100 мг/кг) и БД3 (в дозах 5, 50 и 100 мг/кг) проявляют анксиолитические свойства, а БД4 (во всех исследованных дозах) – анксиогенное. Все тестированные вещества в зависимости от дозы проявляли седативные свойства, однако БД1 (в дозе 100 мг/кг), БД2 и БД3 (в дозе 5 мг/кг) обладали антистрессорным действием.
Результаты теста «черно-белая камера». Диазепам (5 мг/кг) в этом тесте снижал как число выглядываний, так и время выходов в светлый отсек, что указывает на увеличение тревожности [5], и, следовательно, диазепам не проявляет анксиолитические свойства (рис. 2). По-видимому, тест «черно-белая камера» не является «работающей» моделью для проявления анксиолитических эффектов диазепама в этой дозе.
БД1 в дозах 5 и 100 мг/кг увеличивал число выглядываний (по сравнению с контролем на 183 и 46,3 % соответственно), однако в дозах 25 и 50 мг/кг достоверных изменений этого показателя не выявлено (рис. 2, а). Поскольку рост количества выглядываний указывает на увеличение ИА [5], то из наших данных следует, что БД1 в дозах 5 и 100 мг/кг способен проявлять анксиолитические свойства.
Рис. 2. Влияние 1,5-бензодиазепинон-2и его производных (в указанных под гистограммами дозах (мг/кг)) на поведение крыс в тесте «черно-белая камера». Примечания, как на рис. 1. Выгляд – число выглядываний, выход – время выходов
Относительно контроля БД2в дозах 5 и 100 мг/кг полностью подавлял как выглядывания, так и выходы крыс в светлый отсек камеры, а в дозах 25 и 50 мг/кг достоверно снижал число выглядываний (рис. 2, б), что ясно указывает на наличие у него выраженных анксиогенных свойств [5].
Результаты теста ЧБК показали, что БД3в дозах 5, 25 и 100 мг/кг снижал число выглядываний, а дозе 50 мг/кг этот показатель был на уровне контроля. При этом в дозе 5 мг/кг количество выходов увеличивалось на 87,5 %, а в 100 мг/кг – наоборот снижалось на 75 %. В дозах 25 и 50 мг/кг по отношению к контролю количество выходов изменялось недостоверно (рис. 2, в). Очевидно, действительно в малых дозах транквилизаторы могут оказывать растормаживающее действие, проявляющееся повышением психомоторной активности, что связано с развитием феномена «торможение-торможения», формирующимся на первом этапе действия БД [4]. В высокой дозе, транквилизирующий эффект реализуется за счет перенасыщения специфических рецепторов молекулами БД, что приводит к блокированию активности центральных тормозных нейронов и активности возбуждающих. В тоже время отсутствие таковых эффектов в дозах 25 и 50 мг/кг, вероятно связано со снижением бензодиазепиновой рецепции с инактивацией ГАМК-рецептора при стрессе, то есть уменьшения входа CI– в клетку [7].
Эффекты БД4 во всех исследованных дозах заключались в полном подавлении выходов крыс в светлый отсек и значительным снижением выглядываний по сравнению с контролем (рис. 2, г). Все это согласно [5] свидетельствует о выраженном анксиогенном действии этого вещества.
Таким образом, анализ результатов теста ЧБК показал, что БД1 и БД3 дозозависимо могут проявлять анксиолитические свойства, а эффекты БД2 и БД4 – анксиогенные.
Результаты теста «подвешивание за хвост». Диазепам (5 мг/кг) в условиях данного теста увеличивал (до 409,5 %; р = 0,001) латентный период им мобильности (ЛПИ; на рис. 3 не показано), что указывает на развитие депрессии у крыс [8], то есть он усиливает депрессию. После введения тестированных веществ было обнаружено (см. рис. 3), что только БД4 и лишь в дозе 100 мг/кг снижал ЛПИ, а эффекты БД1, БД2 и БД3 практически во всех исследованных дозах были направлены на усиление депрессии.
Рис. 3. Влияние 1,5-бензодиазепинона-2 и его трех производных (в указанных под гистограммой дозах (мг/кг)) на изменение латентного периода иммобильности в тесте «подвешивание за хвост». Примечания, как на рис 1. ЛПИ – латентный период иммобильности
Результаты теста Порсолта. Из рис. 4 видно, что диазепам (в дозе 5 мг/кг) в этом тесте снижал основной маркер депрессии – время активного плавания (ВАП), что согласно [10] указывает на развитие депрессии. Таким образом, по результатам данного теста диазепам в дозе 5 мг/кг не обладает антидепресантными свойствами, а наоборот, приводит к усилению моделируемой депрессии.
Из рис. 4, а, б и в также видно, что БД1, БД2 и БД3 во всех исследованных дозах снижали ВАП по сравнению с контролем, то есть приводили к развитию депрессии, а БД4 в дозах 5 и 25 мг/кг увеличивал (на 87,3 и 15,2 % соответственно) ВАП крыс (рис. 4, г), что свидетельствует о проявлении антидепрессантных свойств [10].
В целом, из выше изложенного следует, что в зависимости от дозы под влиянием тестированных веществ поведение крыс в разных моделях стресса может существенно изменяться. Так, в условиях слабого стресса (тест «открытое поле») анксиолитические свойства проявляются у БД1, БД2 и БД3, а БД4 показал выраженный анксиогенный профиль. В условиях стресса среднего уровня (тест «черно-белая камера») БД1 и БД3 показали противотревожное действие, а в условиях сильного уровня стресса (Порсолта и «подвешивание за хвост») БД1 и БД4проявлялиантидепрессантные свойства, а БД2 и БД3, наоборот, усиливали депрессию.
Результаты исследования показали, что тестированные бензодиазепины обладают психотропной активностью, превосходящей в некоторых дозах эффекты диазепама. Мы полагаем, что исследованные вещества можно рекомендовать для дальнейшего доклинического изучения и на основе результатов настоящих экспериментов могут быть разработаны пилотные клинические испытания этих агентов в качестве средств лекарственной коррекции здоровья, восстановления психического и функционального состояния людей, чей труд связан напряженными и стрессовыми факторами. В отношении механизма действия 1,5-бензодиазепинона-2 можно думать, что он такой же, как и у других бензодиазепинов [9], которые в нейронах увеличивают поступление С1–, выход К+ и снижение поступления Na+ и Са2+, обусловливая развитие торможения в центральной нервной системе.
Рис. 4. Влияние 1,5-бензодиазепинона-2и его трех производных (в указанных под гистограммами дозах (мг/кг)) на поведение крыс в тесте Порсолта. Примечания, как на рис. 1. ЛППЗ– латентный период первого зависания, ВАП – время активного плавания, КВ – количество выпрыгиваний
Выводы
1. Установлено, что 1,5-бензодиазепинон-2 и его три новых производных в зависимости от дозы и мощности стресса способны проявлять психотропные (антистрессорные, анксиолитические, седативные, антидепрессантные) свойства, превосходящие действие эталонного препарата диазепама.
2. 1,5-бензодиазепинон-2 и его производные (4-метил-1,5-бензодиазепинона-2, 3-метил-1,5-бензодиазепинона-2 и 5-формил-3-метил-1,5-бензодиазепинона-2) могут быть рекомендованы для дальнейшего изучения их биологических свойств.