Метапневмовирусы, как и другие биологические объекты, обладают свойствами, передаваемыми по наследству. Наряду со свойствами, общими для всех вирусов, имеются признаки, которые могут быть выражены в разной степени у вариантов одного и того же вируса. Эти свойства, играющие основную роль в дифференциации штаммов (вирусов), носят название генетических признаков.
Так как генетические признаки являются отражением особенностей вирусного генома, изменение их может служить показателем эффективности различных экспериментальных воздействий на генетический материал вируса, включая химический и физический мутагенез.
Установлено, что вирулентные и аттенуированные штаммы вируса могут различаться по ряду генетических признаков, тщательное их изучение приобрело особое значение для отбора природно-ослабленных и искусственно полученных вакцинных вариантов.
Усовершенствование имеющихся методов контроля и научно-практическая разработка новых методов контроля вакцинных штаммов метапневмовируса птиц в процессе изготовления и применения вакцин против этой болезни, как и других биопрепаратов, должно складываться из следующих основных направлений:
а) применение современных методов оценки производственных штаммов, характеризующих их иммунобиологические особенности – детальная проверка генетических признаков, их вариабельности в организме и в культурах клеток;
б) применение высокочувствительных и стабильных клеточных культур, не содержащих контаминирующих агентов для контролей производственных штаммов и вакцин;
в) использование иммунных типоспецифических сывороток (не гипериммунных и не гамма-глобулинов) для типирования производственных штаммов и эталонов для контроля иммуногенной и антигенной активности производственных серий вакцин.
Целью настоящей работы явилось изучение генетических маркеров вакцинных штаммов метапневмовируса птиц, связанных с особенностями их внутриклеточной репликации и выявляемых in vitro.
Материалы и методы исследований
При выполнении работы использовали вакцинные штаммы 8544 подтипа А (G.P Wilding et al., 1986) [8] и VC-03 подтипа В (Y.P. Picault et al., 1987) [7] МПВ птиц, культивируемые в клетках Vero.
Эксперименты ставили на первично-трипсинизированных культурах фибробластов СПФ эмбрионов кур (ФЭК), эмбрионов гусей (ФЭГ), трахеальной органной культуре (ТОК) куриных эмбрионов, перевиваемой линии клеток Vero (институт гриппа АМН, Санкт-Петербург).
Культивирование культур клеток проводили с использованием питательных сред Игла МЕМ и/или ДМЕМ и № 199, растворов версена 0,02 %, Хенкса фирмы «Hyclone, раствора трипсина 0,25 % фирмы «US BIO производства ООО «Биолот, Санкт-Петербург, сыворотки крови крупного рогатого скота и плодов коровы.
Приготовление культуры клеток, титрование вируса по цитопатогенному действию, изучение маркеров штаммов проводили по методам, описанным в руководстве по вирусологии [3].
Способность штаммов вируса к репликации в культуре клеток при различных температурах определяли по методу М. Беньеш-Мельник, Дж. Л. Мельник (1961) [1], в основе которого лежит вычисление разности между титрами штаммов вируса при температуре 37 и 34 °С или 37 и 40 °С.
Результаты исследований и их обсуждение
Репликация вакцинных штаммов 8544 и VC-03 МПВ птиц в культуре ФЭК сопровождалась цитопатическим эффектом с первого пассажа, и этот феномен обнаруживался через 48–72 часа после инокуляции клеток. В культуре ФЭУ и ФЭГ штаммы вируса адаптировались со 2–3 пассажа. Штаммы 8544 и VC-03 индуцировали острую форму вирусной инфекции в первичных культурах различным латентным периодом в зависимости от вида культуры клеток.
Характер цитопатогенного действия (ЦПД) выражался в округлении клеток с зернистостью в цитоплазме на ограниченных участках монослоя через 48–72 часа. На 4–5 сутки инкубации зернистость наступала по всему монослою. Полную дегенерацию и гибель ФЭК отмечали на 6–7 сутки и 8–9 сутки ФЭУ и ФЭГ после инфицирования с образованием разной величины синцитиальных формаций.
Данные, приведенные в табл. 1, показали, что в культуре ФЭК вакцинные штаммы 8544 и VC-03 накапливались в 5-ом пассаже в титрах 5,25 ± 0,2 и 5,75 ± 0,1 lg ТЦД50/см3 соответственно. В культурах ФЭУ титры были 2,75 ± 0,3 и 3,1 ± 0,3 lg ТЦД50/см3 и ФЭГ – 3,0 ± 0,2 и 3,7 ± 0,1 lg ТЦД50/см3.
Данные, представленные в табл. 2, показали, что вакцинные штаммы 8544 и VC-03 имели максимальное накопление 6,25 ± 0,1 и 6,75 ± 0,1 lg ТЦД50/см3 соответственно, в клетках Vero с посевной концентрацией 2×105 кл/см3 при инокуляции монослоя через 48–72 ч и времени съема вируса через 72 ч после заражения.
При микроскопическом изучении клеток Vero, инфицированных вакцинными штаммами МПВ птиц, отмечали характерные аналогичные цитопатические изменения в монослое и структуре клеток через различные сроки после инокуляции.
Таблица 1
Инфекционные титры вакцинных штаммов МПВ птиц в первично-трипсинизированных культурах клеток (n = 5)
|
Наименование культур клеток |
Штамм вируса |
Титр вируса, lg ТЦД50/см3, M ± m* |
||
|
Число пассажей |
||||
|
1 |
3 |
5 |
||
|
ФЭК |
8544 VC-03 |
5,2 ± 0,1 5,75 ± 0,2 |
5,33 ± 0,15* 5,66 ± 0,2 |
5,25 ± 0,2 5,75 ± 0,1 |
|
ФЭУ |
8544 VC-03 |
1,75 ± 0,2 2,5 ± 0,1 |
2,5 ± 0,15 3,2 ± 0,2 |
2,75 ± 0,3 3,1 ± 0,3 |
|
ФЭГ |
8544 VC-03 |
1,66 ± 0,2 2,75 ± 0,1 |
2,1 ± 0,25 2,75 ± 0,1 |
3,0 ± 0,2 3,7 ± 0,1 |
Таблица 2
Влияние посевной концентрации клеток Vero, их возраста и времени съема вируса на его величину инфекционного титра в клетках Vero (n = 3)
|
Время съема вируса,ч |
Возраст клеток Vero, ч |
Множественность заражения, ТЦД50/кл |
Концентрация клеток, тыс/см3 |
Титр инфекционности вируса, lg ТЦД50/см3, M ± m* |
|
|
8544 |
VC-03 |
||||
|
24 |
48–72 |
0,5 |
200 |
3,5 ± 0,1* |
3,75 ± 0,2 |
|
48 |
48–72 |
0,5 |
200 |
6,1 ± 0,3 |
6,5 ± 0,2 |
|
72 |
48–72 |
0,5 |
200 |
6,25 ± 0,1 |
6,75 ± 0,1 |
|
96 |
48–72 |
0,5 |
200 |
6,0 ± 0,3 |
6,5 ± 0,4 |
Системой, выбранной для выделения и изучения биологических свойств МПВ птиц, является ТОК [4, 5].
В опытах для получения ТОК использовали 18-суточные СПФ эмбрионы кур. При культивировании вакцинных штаммов 8544 и VC-03 МПВ птиц в ТОК установлено, что штаммы вызывали незначительное снижение активности ресничек слизистой на 3–5 % и 7 % соответственно. Степень репликации штаммов вируса в клетках эпителия определяли методом титрования в клетках Vero.
Таблица 3
Титры инфекционности вакцинных штаммов МПВ в трахеальной органной культуре
|
Штаммы вируса |
Титры вируса, lg ТЦД50/см3, M ± m* |
||
|
Число пассажей |
|||
|
1 |
2 |
3 |
|
|
8544 VC-03 |
5,1 ± 0,2* 5,4 ± 0,3 |
5,3 ± 0,33 5,5 ± 0,25 |
5,33 ± 0,15 5,55 ± 0,15 |
Данные, приведенные в табл. 3, показали, что штаммы 8544 и VC-03 вируса накапливались в ТОК в титрах 5,33 ± 0,15 и 5,55 ± 0,15 lg ТЦД50/см3 соответственно.
В процессе изучения культуральных свойств штаммов МПВ птиц была определена чувствительность различных клеточных культур к испытуемым штаммам относительно клеток Vero, которые выражали в индексе чувствительности. По чувствительности клеточные культуры расположились в следующем порядке: ФЭК, ТОК, ФЭГ и ФЭУ.
Результаты исследования по изучению культуральных маркеров вакцинных штаммов 8544 и VC-03 свидетельствуют о том, что способность их к репликации в клеточных культурах различна и подтверждается данными других авторов [2, 6].
Способность вакцинных штаммов МПВ к репликации при температурах 34, 37 и 40 °С изучали в клетках Vero в процессе пяти пассажей (RctTC – признак).
Полученные данные, представленные в табл. 4, показали, что штаммы вируса вызывали ЦПД в клетках Vero и накапливались при неоптимальных температурах культивирования в высоких титрах: штамм 8544 - 5,5 ± 0,2 lg ТЦД50, штамм VC-03 - 6,5 ± 0,25 lg ТЦД50 при 34 °С и при 400 °С 5,8 ± 0,15 lg ТЦД50, 6,5 ± 0,05 lg ТЦД50 соответственно. Они характеризовались как rctTC+ штаммы.
Таблица 4
Способность вакцинных штаммов МПВ к репликации при различных температурах и определение rctTC признака
|
Штамм вируса |
Инфекционный титр вируса, lg ТДЦ50/см3 (М ± m) * |
|||||||
|
Температура культивирования |
||||||||
|
Rct 34° 5пассаж |
Индекс подавления репликации вируса lg ТДЦ5037°–lg ТДЦ5034°** |
Характеристика штамма по rct 35° |
Rct37° |
Характеристика штамма по rct 37° |
Rct40° 5пассаж |
Индекс подавления репликации вируса lg ТДЦ50 37°–lg ТДЦ50 40°** |
Характеристика штамма по rct 40° |
|
|
8544 |
5,5 ± 0,2* |
0,75 ± 0,01 |
+ |
6,25 ± 0,2 |
+ |
5,8 ± 0,15 |
0,45 ± 0,01 |
+ |
|
VC-03 |
6,5 ± 0,45 |
0,25 ± 0,05 |
+ |
6,75 ± 0,5 |
+ |
6,5 ± 0,5 |
0,25 ± 0,05 |
+ |
Примечание. * М ± m, ** разница в титрах вируса при 37 и 34 °C (37 и 40 °C).
Способность вакцинных штаммов МПВ птиц к индукции интерферона изучали в клетках Vero множественностью заражения 0,01; 0,1 и 1,0 ТЦД50 на клетку. Данные опытов свидетельствовали, что концентрация интерферона в культуральной жидкости была в прямой зависимости штаммов-индуцентов и времени отбора проб после инокуляции клеток Vero. Наибольшую активность интерферона отмечали через 72–96 часов культивирования.
Штаммы 8544 и VC-03 существенно не отличались по интерфероногенной активности и по чувствительности к гомологичному эндогенному интерферону и характеризовались как If+ и sIf+ штаммы.