Scientific journal

Advances in current natural sciences

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

Сахарный диабет 1 типа (СД1) – полигенное многофакторное заболевание, развитие которого связано с аутоиммунной деструкцией β-клеток поджелудочной железы.

Генетическая предрасположенность играет определяющую роль в механизмах манифестации и прогрессирования аутоиммунного воспаления при СД1 [2, 4].

К настоящему времени известно 50 генов, находящихся на разных хромосомах, которые в той или иной степени предрасполагают к СД1. Из них 16 ассоциированы с развитием не только СД1, но и других аутоиммунных заболеваний (АИЗ), таких как: АИЗ щитовидной железы (АИЗ ЩЖ), болезнь Аддисона, целиакия, системная красная волчанка, ревматоидный артрит [10].

Наибольший вклад в предрасположенность к СД1 и другим АИЗ принадлежит локусу IDDM1, на котором находятся гены главного комплекса гистосовместимости HLA II класса [2]. Расположенный на коротком плече 6 хромосомы (6p21), локус HLA II класса у людей, по оценкам ученых, вносит примерно 40–50 % от общего вклада в наследственный риск развития СД1.

Еще одним геном, который также вносит существенный вклад в предрасполо-женность к СД1 и другим АИЗ, является ген PTPN22. Он находится на первой хромосоме (1p13.3-p13.1). Его белковый продукт принадлежит к семейству белков тирозиновой фосфатазы (ЛФТ), которая является мощным ингибитором антигена Т-клеточного рецептора сигнального пути. Замена аргининового на триптофановый аминокислотный остаток (кодон 620 – R620W) исключает возможность взаимодействия PTPN22 с CSK, что приводит к нарушению обратной регуляции активированных лимфоцитов [1, 7–9].

Из всех вариантов сочетаний АИЗ наиболее часто встречается сочетание СД1 и АИЗ ЩЖ. До 50 % больных СД1 имеют положительные титры антител к ткани щитовидной железы, из них примерно у 50 % отмечаются клинические проявления АИЗ ЩЖ [9, 11, 12]. Такое глубокое взаимопроникновение одной патологии в другую, с одной стороны, существенно затрудняет изучение патогенетических механизмов развития каждого из компонентов синдрома, а с другой стороны делает эту модель поистине уникальной в плане перспектив изучения общих иммунопатологических механизмов.

Задачей настоящего исследования является сравнительный анализ распределения частот генотипов гена DRB1 HLA II класса и их сочетаний с генотипами CT/TT полиморфизма rs 2476601 гена PTPN22 у пациентов с СД1 и пациентов, имеющих сочетание СД1 с АИЗ ЩЖ.

Материалы и методы исследования

В исследование было включено 249 пациентов с СД1, которые находились на обследовании и лечении в ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ. Все пациенты были разделены на 3 группы: в первую группу вошло 89 пациентов с СД1 и аутоиммунным тиреоидитом (АИТ) (средний возраст пациентов 33,0 ± 14,0 лет, из них мужчин – 13 (0,146), женщин – 76 (0,854)), вторую группу составили 22 пациента с СД1 и диффузным токсическим зобом (ДТЗ) (средний возраст пациентов 33,1 ± 16,4 лет, из них мужчин – 7 (0,318), женщин – 15 (0,682)), в третью группу вошло 138 пациентов с СД1 и отрицательными титрами антител к ткани щитовидной железы (АтЩЖ) (средний возраст пациентов 24,2 ± 12,9 лет, из них мужчин – 68 (0,491), женщин – 15 (0,682)). Контрольную группу составили 108 человек из Московской популяции без аутоиммунных заболеваний и отягощенной наследственности по ним, средний возраст в контрольной группе (n = 108) – 46,3 ± 9,3 лет, мужчин 73 (68 %), женщин – 35 (32 %). У всех пациентов предварительно было получено информированное согласие на проведение данного исследования.

HLA-генотипирование по аллельным вариантам гена DRB1 HLA II класса выполнялось методом сиквенс-специфических праймеров с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для определения полиморфных аллелей данного гена применялись коммерческие наборы производства ЗАО «НПФ ДНК-Технология» (Россия). Амплификацию производили на амплификаторах «Терцик» (Россия).

Типирование однонуклеотидного полиморфизма rs 2476601 гена PTPN22 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флюоресцентными метками и автоматической регистрацией результатов реакции в режиме реального времени (real-time PCR) наборами компании «ДНК-Технология» (Москва) на приборе ДТ-96 («ДНК-Технология») в соответствии с инструкциями производителя.

Количественное определение титров аутоантител к тиреоглобулину (ATG) и тиреопероксидазе (ATPO) в сыворотках крови осуществляли методом непрямого иммуно-ферментного анализа с использованием наборов фирмы «Biomerica» (лаборатория клинической биохимии ФГБУ «Эндокринологический научный центр» МЗ РФ, зав. – А.В. Ильин).

Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных подходов, используемых при проведении популяционно-генетических исследований.

Аллельные варианты полиморфного гена подвергались классическому молекулярно-эпидемиологическому анализу – сопоставлению встречаемости аллелей и генотипов у больных СД1, СД1+АИТ и контролей.

Ассоциацию между заболеванием и генотипом определяли с помощью критерия χ2 (c коррекцией Йейтса на непрерывность выборки), либо точным двусторонним критерием Фишера, сравнивая распределение генотипов и аллелей по каждому полиморфизму между группами пациентов и контролей. Статистика: аллель предрасположенности (риска) А против второго аллеля (протекторного) В.

Показатели «отношения шансов» (OR-odds ratio) с 95 % доверительным интервалом (95 % CI) рассчитывались для «редкого» аллеля, носителей «редкого» аллеля (гетерозигот + гомозигот по «редкому» аллелю) относительно «частых» аллелей и гомозигот по «частому» аллелю соответственно. Аналогичный расчет проводился для гомозигот по «редкому» аллелю относительно гетерозигот и гомозигот по «частому» аллелю.

Сравнение частот встречаемости сочетаний генотипов проводилось с использованием точного двустороннего критерия Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение

Нами был проведен сравнительный анализ распределения частот генотипов гена DRB1 HLA II класса у пациентов с СД1 и СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ с учетом известных предрасполагающих/защитных вариантов гена DRB1 HLA II класса [5]. Все типированные образцы от больных СД1 в зависимости от HLA-генотипа были разделены на три группы: группа высокого риска (ГВР), если в генотипе присутствовали любые два варианта гена DRB1 из группы DRB1: *01, *03, *04, *08, *09, *10; группа низкого риска (ГНР) – в генотипе присутствовали любые два варианта гена DRB1: *07, *11, *12, *13, *14, *15, *16; группа промежуточного риска (ГПР), если в генотипе один вариант был из группы DRB1: *01, *03, *04, *08, *09, *10, а другой – из группы DRB1: *07, *11, *12, *13, *14, *15, *16 [3].

Исследование частоты встречаемости вариантов генотипов гена DRB1 HLA II класса.

Нами не было получено значимых отличий по исследуемым генам между группами СД1+АИТ и СД1+ДТЗ, поэтому при дальнейшем анализе эти группы были объединены в одну общую – СД1+АИЗ ЩЖ.

Анализ распределения частот генотипов гена DRB1 HLA II класса выявил отсутствие различий по распределению ГВР, ГПР и ГНР в группах СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ (p = 0,5819) и достоверное различие в распределении частоты встречаемости этих групп генотипов у пациентов с СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ по сравнению с группой контроля (p < 0,0001). В частности, было показано повышение встречаемости ГВР в группах больных СД1, серонегативных по АтЩЖ, – 86/0,623 (p < 0,0001), OR = 12,09 (6,158–23,72) и пациентов с сочетанием СД1 и АИЗ ЩЖ – 68/0,613 (p < 0,0001), OR = 11,56 (5,772–23,14) по сравнению со здоровыми лицами 13/0,12 (табл. 1).

Помимо основных групп генотипов гена DRB1 HLA II класса (высокого и низкого риска для развития СД1) было выделено 6 генотипов: 1/4, 4/4, 4/7, 4/13, 4/17, 17/17, показавших наибольшую частоту встречаемости в исследуемых группах пациентов. Для четырех из них было получено достоверное отличие частоты в группах СД1 и контроля: 1/4 – p < 0,0001, OR = 33,32 (1,982–559,9); 4/13 – p = 0,0088, OR = 5,984 (1,329–26,94); 4/17 – p < 0,0001, OR = 61,00 (3,681–1011); 17/17 – p = 0,0054, OR = 15,92 (0,9154–276,8), для двух – в группах СД1 + АИЗ ЩЖ и контроля: 1/4 – p = 0,0016, OR = 22,45 (1.298–388.3); 4/17 – p < 0,0001, OR = 59,00 (3,557–978,5). При этом генотип 13/17, относящийся к группе генотипов промежуточного риска, показал в настоящем исследовании достоверно большую встречаемость при СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ по сравнению с контрольной группой. Также обращала внимание некоторая неоднородность изолированного СД1 и СД1 в сочетании с АИЗ ЩЖ по спектру генотипов риска – 4 для СД1 и только 2 для СД1+АИЗ ЩЖ. При этом непосредственно между группами достоверных отличий получено не было. Интересно, что генотип 4/4, традиционно относимый к генотипам высокого риска, в нашей выборке не показал достоверного отличия частоты встречаемости между группами СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ и по сравнению с группой контроля (табл. 2).

В предыдущей работе нами получена достоверная ассоциация полиморфизма rs 2476601 гена PTPN22 с повышенным риском развития сочетания СД1 и АИЗ ЩЖ. При этом было установлено, что аллель Т и генотип ТТ являются аллелем и генотипом высокого риска для развития аутоиммунного полигландулярного синдрома 2 типа [6]. В связи с этим нами было проанализировано распределение частоты встречаемости сочетания ГВР гена DRB1 HLA II класса с генотипами СТ и ТТ гена PTPN22 как носителями аллеля высокого риска между группами СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ. Также было проанализировано распределение частоты встречаемости сочетания ГПР гена DRB1 HLA II класса с генотипами СТ и ТТ гена PTPN22 как носителями аллеля высокого риска между группами СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ. Было показано, что группы СД1+АИЗ ЩЖ и СД1 не отличаются по частоте встречаемости ГПР в сочетании с генотипами CT/TT гена PTPN22 – 22/110 (0,2) и 15/134 (0,11) соответственно (p = 0,0724). Изолированно генотип TT гена PTPN22 в сочетании с ГВР гена DRB1 HLA II класса встречается крайне редко и достоверных отличий между исследуемыми группами не показал.

Нами также было проанализировано распределение частоты встречаемости сочетания генотипов гена DRB1 HLA II класса, определенных в настоящем исследовании как генотипы риска (1/4, 4/13, 4/17, 17/17), с генотипами СТ и ТТ гена PTPN22 (носителями аллеля высокого риска) между группами СД1 и СД1+АИЗ ЩЖ (табл. 3).

Было показано, что группы СД1+АИЗ ЩЖ и изолированный СД1 не отличаются по частоте встречаемости генотипов 1/4, 4/13, 4/17, 17/17 в сочетании с генотипами CT/TT гена PTPN22, что, с нашей точки зрения, можно объяснить общностью генотипов гена DRB1 HLA II класса для исследуемых групп.

Таблица 1

Сравнительный анализ распределения частот генотипов гена DRB1 HLA II класса высокого, низкого и промежуточного риска по развитию аутоиммунных заболеваний в исследуемых группах и контроле