Цикл жизни многих типов клеток, в том числе и сперматозоидов, может зависеть от присутствия факторов смерти, которые могут активизировать суицидную программу – программу гибели клетки – апоптоз. Ключевой молекулой запуска процесса апоптоза является клеточный рецептор СD95(Fas) – поверхностный белок мембраны клеток, который используется при управлении апоптозом в течение сперматогенеза у множества разновидностей млекопитающих и у человека [2]. Однако экспрессия рецептора апоптогенного сигнала СD95 на клетках свидетельствует лишь о потенциальной готовности клетки при наличии дополнительных факторов к рецепторному апоптозу, но не является доказательством апоптоза [3, 8].
Данные литературы о наличии на поверхности сперматозоидов маркёра апоптоза СD95 довольно противоречивы: одни исследователи выявляют экспрессию СD95 на сперматозоидах фертильных и субфертильных мужчин, а другие – нет. Причиной этого могут быть различные методы определения рецептора, а также качество реагентов (например, применение разных антител для обнаружения СD95). Некоторые исследователи считают, что при различных нарушениях сперматогенеза наблюдается изменение экспрессии СD95 на сперматозоидах, отражая активность патологических процессов, протекающих в мужской репродуктивной системе. Кроме того, не многие исследователи пытались выявить корреляцию между экспрессией СD95 и некоторыми морфофункциональными характеристиками сперматозоидов [2, 9, 10].
Цель исследования
Таким образом, в мировой литературе к настоящему времени нет единого мнения исследователей по поводу экспрессии СD95 на половых клетках, что определило цель данного исследования, которая состояла в попытке выявить на поверхности сперматозоидов рецептор СD95 и обнаружить взаимосвязь между экспрессией этого маркёра апоптоза и морфофункциональными параметрами спермы.
Материалы и методы исследования
Для проведения исследования образцы эякулятов 78 субфертильных мужчин (33,5 ± 1,0 лет) были собраны мастурбацией в стерильные пластмассовые стаканчики. Сбор эякулятов производился после 72 ч сексуального воздержания. В течение 30 мин при комнатной температуре (22 °C) эякуляты были оставлены для разжижения, после чего каждый образец разделялся на две части: один для анализа морфо-функциональных параметров, другой для выявления на поверхности сперматозоидов экспрессии СD95.
Измерение показателей стандартной спермограммы проводили согласно рекомендациям и нормативам ВОЗ [7].
В качестве морфофункциональных характеристик качества спермы были выбраны двигательные и морфологические параметры, а также концентрация сперматозоидов в эякуляте.
Сперматозоиды выделяли из образцов эякулятов методом простого отмывания от семенной плазмы фосфатно-солевым буфером pH = 7,4.
Выявление экспрессии СD95 на клетках включало в себя обработку сперматозоидов соответствующими моноклональными антителами с последующей флюоресцентной микроскопией. Для этого использовали меченные фикоэритрином (РЕ) моноклональные антитела CD95 (CD95-РЕ, IgG1, Caltag Lbs.), согласно инструкции производителя.
Микроскопические исследования проводили на флюоресцентном микроскопе «МИКРОМЕД 3 ЛЮМ» (Санкт-Петербург) под иммерсионным объективом (×100).
Полученные результаты исследований обработаны с использованием программы «Statistica 7.0». О достоверности различий судили по величине t-критерия Стьюдента. Статистически достоверными считали различия, соответствующие оценке ошибки вероятности р ≤ 0,05. Оценка взаимосвязи исследуемых показателей осуществлялась подсчётом коэффициента корреляции (r) Пирсона.
Результаты исследования и их обсуждение
У 53 % (у 41 из 78) субфертильных мужчин более 10 % сперматозоидов в эякуляте оказались СD95-положительными (СD95+). При этом у 47 % обследованных мужчин этот антиген на сперматозоидах не выявлен.
Выявленная экспрессия СD95-антигена, вероятнее всего, произошла ещё в период сперматогенеза и эти маркированные клетки должны были быть устранены ещё тогда в процессе апоптоза, но, по каким-то причинам, механизмы апоптоза не были закончены, либо были отложены, либо функционировали неправильно – неполный апоптоз или «абортивный апоптоз» [6].
Анализ корреляции между процентным содержанием в эякулятах субфертильных мужчин СD95+ сперматозоидов и морфофункциональными характеристиками эякулятов, дал следующие результаты: обнаружена достоверная отрицательная корреляция между концентрацией сперматозоидов в эякуляте и количеством СD95+ сперматозоидов (r = – 0,46; p < 0,001); подвижность сперматозоидов положительно коррелировала с содержанием СD95+ клеток в сперме (r = 0,31; p < 0,05); выявлена положительная корреляция между числом СD95+ клеток и количеством атипичных форм сперматозоидов в эякуляте (r = 0,4; p < 0,01).
Таким образом, данные корреляционного анализа показывают, что часть тех сперматозоидов, которые оценены как активно подвижные у субфертильных пациентов, были маркированы СD95 и предрасположены при наличии дополнительных факторов к смерти через СD95-зависимый рецепторный апоптоз, что подтвердилось положительной корреляцией количества СD95+ клеток с подвижностью [4, 5].
Положительная корреляция СD95+ клеток с наличием в эякуляте атипичных форм сперматозоидов также свидетельствует о том, что эти клетки потенциально уготовлены к гибели по рецепторному пути апоптоза, когда сигналы к его запуску поступают извне и опосредованы через СD95-рецепторы [1].
Заключение
Полученные данные о достоверной связи между экспрессией рецептора апоптогенного сигнала СD95 и морфофункциональными характеристиками сперматозоидов убедительно показывают, что экспрессия СD95 на сперматозоидах, является фактором, снижающим фертильность спермы, что несомненно должно быть учтено при подготовке спермы для вспомогательных репродуктивных технологий.