Одной из актуальных проблем ортопедии и травматологии является разработка новых способов возмещения дефектов костной ткани. Опыт оперативного лечения обширных дефектов трубчатых костей конечностей без замещения остеопластическими материалами указывает на интерпозицию мягких тканей как причину нарушения консолидации переломов, приводящую к анатомическим изменениям и функциональным расстройствам конечности [8]. Применение биокомпозитного материала «ЛитАр» (РУ № 29/13050501/3011–02 от 18.02.2002 г. МЗ Российской Федерации) позволяет добиться реституции костной ткани при лечении обширных дефектов трубчатых костей после удаления доброкачественных опухолей и опухолеподобных образований [1, 6, 7], в случае замедленной консолидации перелома и ложного сустава [4], в стоматологической практике [9]. Клинические исследования, выполненные методами рентгенографии и компьютерной томографии, подтверждают заполнение области дефекта рентгеноплотными тканями при той же продолжительности или сокращении средних сроков лечения по сравнению с методиками, предусматривающими использование костных аутотрансплантатов [2, 3, 6]. Однако гистологические аспекты влияния данного препарата на течение репаративного процесса до сих пор мало изучены [5].
Целью исследования являлась морфологическая характеристика влияния препарата «ЛитАр» на течение репаративного остеогенеза при восполнении дефектов длинных трубчатых костей.
Материалы и методы исследования
Эксперимент выполнен на 15 взрослых беспородных животных (собаки), которым в условиях операционной создавали полуциркулярный дефект в средней трети большеберцовой кости глубиной ½ диаметра и высотой, равной поперечному размеру диафиза (1,3–1,5 см). Полученный дефект заполняли коллаген-апатитовой губкой препарата «ЛитАр». На оперированную конечность монтировали аппарат Илизарова. Животных выводили из опыта передозировкой тиопентала натрия («Синтез», Россия) на 7-е, 14-е, 30-е сутки периода фиксации, 65-е, 90-е и 150-е сутки в периоде после снятия аппарата (хирург – к.в.н. М.А. Степанов). Уход, оперативные вмешательства, эвтаназию животных осуществляли в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения РФ к работе экспериментально-биологических клиник, а также Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей.
Материал для гистологических исследований забирали после эвтаназии при выведении животного из опыта. Диафизы трубчатых костей фиксировали в 10 %-м растворе нейтрального формалина, после дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и декальцинации в 7–10 % растворе азотной кислоты заливали в целлоидин. Гистотопографические срезы толщиной 20–25 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по методу Ван-Гизона. Исследование и микрофотосъемку препаратов проводили с использованием фотомикроскопа («Opton», Германия) и смонтированной на нем цифровой видеокамеры «SONY DCR-TRV 340E». Оцифрованные изображения сохраняли, используя АПК «ДиаМорф» (Россия).
Результаты исследования и их обсуждение
Через 7 суток эксперимента полость полуциркулярного дефекта диафиза заполняла реактивно измененная рыхлая волокнистая соединительная ткань (рис. 1, а, б). Ближе к периостальной поверхности обнаруживались фрагменты имплантируемого препарата «ЛитАр». Они имели неправильную форму и обладали гомогенной структурой (рис. 1, б). Область регенерации васкуляризировали микрососуды, проникающие со стороны периоста и сохраненной костномозговой полости. На эндостальной раневой поверхности кости наблюдалось формирование грубоволокнистых костных трабекул. Межтрабекулярные промежутки заполняла волокнистая соединительная ткань с включениями жировых клеток.
В костномозговой полости, дистальнее и проксимальнее зоны повреждения, располагался желтый костный мозг с рассеянными клеточными элементами кроветворения и большим количеством полнокровных синусоидов.
Через 14 суток после операции в области дефекта определялась новообразованная трабекулярная костная ткань и небольшие участки волокнистой соединительной ткани (рис. 1, в, г). Эндостальная реакция распространялась проксимальнее и дистальнее области дефекта, тогда как периостальный остеогенез был выражен лишь в проксимальном фрагменте материнской кости. На поверхности новообразованных грубоволокнистых костных трабекул обнаруживалось большое количество остеокластов. Промежутки между ними заполняла рыхлая волокнистая соединительная ткань (рис. 1, г). Ориентация трабекул в интермедиарной части регенерата была перпендикулярной относительно длинной оси кости. В наружном (соединительнотканном) слое надкостницы обнаруживались базофильно окрашенные включения ЛитАра, имеющие неправильную форму.
а) б) в) г)
Рис. 1. Гистоструктурные изменения в области дефекта через 7 и 14 суток фиксации в аппарате. А – гистотопографический срез, окраска гематоксилином и эозином. 7 суток фиксации в аппарате. Увеличение – 1,5х. Б – волокнистая соединительная ткань периферического участка полуциркулярного дефекта с включениями препарата «ЛитАр» через 7 суток фиксации. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение – 63х. В – гистотопографический срез костного регенерата через 14 суток фиксации в аппарате, окраска по Ван Гизону. Увеличение – 1,5х. Г – мелкопетлистая трабекулярная сеть в области дефекта, образованная грубоволокнистой костной тканью через 14 суток фиксации. Окраска пикрофуксином по Ван-Гизону. Увеличение – 63х
а) б) в)
Рис. 2. Гистоструктурные изменения в области дефекта через 30 суток фиксации в аппарате. А – гистотопограмма участка диафиза в области создания полуциркулярного дефекта. Увеличение -1,5х. Окраска пикрофуксином по Ван-Гизону. Б – компактизирующаяся губчатая кость в интермедиарной области полуциркулярного дефекта. Увеличение – 63х. Окраска пикрофуксином по Ван-Гизону. В – формирование костно-остеоидных трабекул вокруг фрагментов имплантируемого материала. Увеличение – 25х. Окраска пикрофуксином по Ван-Гизону
а) б) в)
Рис. 3. Гистоструктурная характеристика диафиза в области дефекта через 90 суток после снятия аппарата. А – гистотопографический срез. Окраска по Ван-Гизону. Увеличение – 1,5х. Б – костная ткань в интермедиарной зоне полуциркулярного дефекта. Увеличение – 63х. Окраска по Ван-Гизону . В – жировой костный мозг и микрососуды в зоне дефекта. Увеличение – 63х. Окраска гематоксилином и эозином
На 30-е сутки эксперимента (окончание периода фиксации в аппарате) область дефекта была заполнена губчатой костной тканью. В интермедиарной зоне продолжалась компактизация новообразованных костных трабекул (рис. 2, а, б).
В костномозговой полости располагалась крупнопетлистая трабекулярная сеть, промежутки которой заполнял красно-желтый костный мозг с расширенными микрососудами, содержащими форменные элементы крови. Надкостница на стороне повреждения была утолщена. В ее соединительнотканном слое сохранялись фрагменты «ЛитАра» неправильной формы, имеющие гомогенную структуру. Вокруг них отмечали сеть новообразованных костных трабекул (рис. 2, в). Проксимальнее и дистальнее области дефекта располагался периостальный костный регенерат.
На 65-е сутки эксперимента (35 суток периода фиксации в аппарате, 30 суток после снятия аппарата) в костном регенерате отмечали перестройку и компактизацию трабекул губчатой костной ткани. В интермедиарном пространстве массивные трабекулы формировали мелкопетлистую сеть, на их поверхности располагались активные остеобласты и 2-, 3-ядерные остеокласты на стадиях прикрепления и резорбции. В эндостальной части регенерата крупные трабекулы ориентировались параллельно длинной оси кости. Их поверхность частично покрывали активные остеобласты, единичные остеокласты находились на стадии прикрепления. Костный мозг межтрабекулярных пространств был ретикулярным либо красным, отечным, кровеносные сосуды гиперемированы. В периостальной части регенерата на уровне дефекта новообразованные трабекулы ориентировались вдоль длинной оси кости. Имплантационный материал располагался в костном веществе трабекул в виде базофильно окрашенных гранул. Костномозговую полость диафиза на уровне дефекта, проксимальнее и дистальнее области повреждения, заполняла эндостально образованная сеть костных трабекул с красно-желтым костным мозгом в промежутках между ними. Периостально образованная губчатая костная ткань подвергалась компактизации. В наружной части волокнистого слоя надкостницы обнаруживались единичные гранулы материала «ЛитАр».
К 90-м суткам эксперимента (60 суток фиксации в аппарате, 30 суток без аппарата) интермедиарное пространство в области полуциркулярного дефекта компактной костной пластинки было заполнено компактизирующейся губчатой костной тканью (рис. 3, а, б). Костномозговая полость содержала жировой костный мозг с рассеянными кроветворными элементами (рис. 3, в). К этому сроку отмечали восстановление целостности а. nutritia в области дефекта. Толщина новообразованного участка компактной костной пластинки в 1,5 раза превышала таковую прилежащих участков вне области повреждения. Имплантационный материал обнаруживался в виде рыхлых, базофильно окрашенных гранул в составе костного вещества. Был отмечен плотный контакт костного матрикса и поверхности гранул «ЛитАр». Периостальная поверхность костного регенерата активно резорбировалась остеокластами, наблюдали утолщение клеточного и волокнистого слоев надкостницы.
Через 150 суток после операции (период фиксации в аппарате – 60 суток, без аппарата – 90 суток) в области дефекта была сформирована компактная костная пластинка. Сосудистые каналы компактной кости регенерата были расширены и содержали рыхлую волокнистую соединительную ткань, васкуляризированную сосудами малого калибра. На периостальной и эндостальной поверхностях была отмечена активность остеобластов и остеокластов, свидетельствующая о перестроечном процессе в костной ткани. Поперечный размер диафиза в области создания дефекта превышал таковой прилежащих участков в 1,5 раза.
В составе костного вещества и соединительнотканного слоя надкостницы обнаруживались базофильно окрашенные, гомогенные по консистенции гранулы экспериментального материала. В утолщенном волокнистом слое надкостницы отмечали очаги остеогенеза и сформированные костные трабекулы, располагающиеся вдоль скоплений «ЛитАра». Компактная костная пластинка диафиза вне области дефекта была утолщена со стороны повреждения, противолежащий ее участок не изменен. В костномозговой полости диафиза на всем ее протяжении располагался желтый костный мозг с редкой сетью гипотрофичных костных трабекул.
Заключение
Согласно результатам проведенного гистологического исследования применение коллаген-апатитового материала «ЛитАр» для восполнения полуциркулярных дефектов диафиза трубчатой кости способствует активизации эндостального, интермедиарного и, в особенности, периостального остеогенеза. Активное течение репаративного процесса обусловлено оптимальным соотношением темпов биодеградации и костеобразования в сочетании с адекватным кровоснабжением области повреждения. Частицы имплантата включаются в состав костного вещества трабекул и обнаруживаются в очагах костеобразования в соединительнотканном слое надкостницы вне области дефекта, что свидетельствует как об остеоиндуктивной, так и остеокондуктивной активности препарата. Типическое строение кости восстанавливается уже к 90-м суткам послеоперационного периода, что в принципе недостижимо при использовании костных аутотрансплантатов [2].