В настоящее время все больше увеличивается удельный рост низкочастотных акустических колебаний (НАК), одним из которых является инфразвук (ИЗ) – диапазон неслышимых звуков. В связи с развитием промышленности и транспорта, особенно в крупных городах, инфразвук становится одним из важных производственных факторов, загрязняющих окружающую среду, тогда как применяемые меры борьбы с ним не всегда эффективны и многие люди значительное время находятся в акустическом поле той или иной интенсивности. В соответствии с современными представлениями, длительно действующий инфразвук с уровнем интенсивности от 90 до 110 дБ является сильным стрессорным фактором и способен вызвать срыв механизмов адаптации организма [1, 2, 6, 7], что приводит к ускоренным темпам старения организма и укорочению биологического возраста населения [8, 9].
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что ИЗ остается в разряде неблагоприятных антропогенных факторов, который изучается гигиенистами с точки зрения оценки вредности и гигиенического нормирования на производстве. Вместе с тем многочисленные клинико-диагностические центры широко применяют данный фактор в качестве физиотерапевтического воздействия для лечения органов пищеварения дыхания, сердечно-сосудистой, эндокринной систем и т.д.
Среди гипотез о путях воздействии ИЗ, существует предположение, что первично повреждаются клеточные мембраны [3, 4, 5, 10, 11]. Поэтому нам представляется актуальным рассмотрение вопроса влияния инфразвука на состояние мембран эритроцитов более полноценно.
Материалы и методы исследования
В экспериментах использовалась свежая цельная донорская кровь здоровых людей. Каждая проба крови делилась на 10 частей: 1 часть контрольная, другие подвергались кратковременному однократному воздействию ИЗ частотой от 1 до 17 Гц.
Осмотическую резистентность определяли в растворах хлористого натрия различной концентрации (0,9–0,35 г/100 мл и 4 М раствор), инкубируя кровь в течение 20 мин при 37 °С и центрифугируя 10 мин при 1000 g. Состояние мембран эритроцитов при сахарозном сжатии определялось инкубированием крови в течение 60 мин при 37 °С в изотоническом (0,3 М) и гипертоническом (0,4 М) растворах сахарозы. Гемолиз эритроцитов при тепловой денатурации проводился в растворах хлористого натрия различной концентрации и инкубированием крови при 50 °С в течение 30 мин. Осмотическую плотность регистрировали при длине волны 540 нм.
Перекисную резистентность эритроцитов определяли [4] разведением крови средой инкубации (СИ) 3 раза, инкубированием в течении 10 мин при 37 °С и по 100 мкл суспензии вносили в 2 мл среды инкубации. Интенсивность перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ) определяли с использованием 3 % раствора Н2О2, в контрольной пробе – СИ. Для получения полного гемолиза использовали 8 % раствор додецилсульфата натрия. Все пробы инкубировали в течении 2 часов при 37 °С, затем центрифугировали 10 мин при 1000 g. Оптическую плотность супернатанта измеряли при 540 нм и степень гемолиза (А) расчитывали по формуле:
А = e * 100/пг,
где e – экстинция опытной пробы; ПГ– экстинция пробы при полном гемолизе
Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием программы Microsoft Excel, с определением М ± м, t-критерия Стьюдента и считали достоверными при р < 0,05 и р < 0,01.
Результаты исследования и их обсуждение
Осмотическую рзистентность (ОРЭ) интактных и прогретых эритроцитов в проведенных экспериментах оценивали по величине осмотического гемолиза. При использовании уменьшающихся концентраций NaCl от 0,9г/100 мл до 0,35г/100 мл кривая гемолиза имеет различную форму, зависящую от частоты инфразвукового воздействия. При частоте ИЗ 5,7 и 9 Гц наблюдается значительное повышение гемолиза. При действии ИЗ 3, 11 и 13 Гц гемолиз увеличивается только в 0,5г/100 мл NaCl. При частоте 1,15 и 17 Гц отмечается уменьшение гемолиза во всех концентрациях хлористого натрия. В связи с этим, для большей наглядности были использованы данные по гемолизу, вызванному только растворами хлористого натрия 0,35 г/100 мл и 0,5 г/100 мл, от максимального гемолиза, вызванного 0,1г/100мл NaНCО3 (т.е. оценивалась максимальная и минимальная резистентность эритроцитов). Все, полученные результаты сравнивались в процентном отношении с контрольной пробой крови, не подвергающейся воздействию инфразвука, в которой гемолиз принят за 100 %.
На рис. 1 представлены результаты опыта по определению резистентности интактных и прогретых эритроцитов крови в растворах хлористого натрия концентрацией 0,35 г/100 мл и 0,5 г/100 мл при воздействии ИЗ различной частоты. Из рисунка видно (рис. 1, А), что инфразвук частотой 5,7,9 Гц повышает уровень гемолиза по сравнению с контрольной пробой крови как интактных, так и прогретых эритроцитов. Однако гемолиз прогретых эритроцитов больше (гемолиз увеличен на 2,7 %, 17,7 % и 20,1 % при воздействии частотами 5,7,9 Гц соответственно), чем интактных (гемолиз увеличен на 2,7 %, 11,2 % при воздействии частотами 7 и 9 Гц соответственно). При частоте 15 Гц уровень гемолиза интактных эритроцитов равен гемолизу в контрольной пробе. При воздействии инфразвуком другими частотами наблюдается снижение уровня гемолиза, причем частоты 3 и 11 Гц дают резкое понижение гемолиза (на 62,4 % и 70,5 % соответственно) от контроля как при инкубации эритроцитов при Т = 50 °С в течение 30 мин., так и интактных.
В растворах хлористого натрия 0,5 г/100 мл (рис. 1, Б) только частоты 1, 15, 17 Гц дают снижение гемолиза, а при воздействии ИЗ другими частотами гемолиз возрастает, причем при тепловой денатурции значительно выше при 3, 11, 13 Гц.
Таким образом, результаты исследования осмотической резистентности эритроцитов показали, что ИЗ оказывает повреждающее действие, что проявляется разрушением эритроцитов и выходом гемоглобина в плазму крови.
В следующей серии экспериментов вызывали гиперосмотическое сжатие эритроцитов добавлением 0,3 М и 0,4 М сахарозы (рис. 2).
Молекула сахарозы не проникает через плазматическую мембрану, что приводит к гемолизу эритроцитов донорской крови in vitro.
При кратковременном однократном действии инфразвука на кровь было зарегистрировано повышение величины гемолиза эритроцитов как в среде инкубации, так и в растворах сахарозы при частоте 5, 7, 9 и 11 Гц. Частоты 13 и 15 Гц не дают видимых изменений, а частоты 1, 3 и 17 вызывают снижение величины гемолиза эритроцитов.
A Б
Рис. 1. Влияние инфразвука на осмотическую резистентность интактных (1) и прогретых (2) эритроцитов. По оси абсцисс: гемолиз, % (за 100 % принят гемолиз в контрольной пробе крови); по оси ординат: частота ИЗ, Гц. А – гемолиз в 0,35 % NaCl, Б – гемолиз в 0,5 % NaCl
Рис. 2. Гиперосмотическое сжатние эритроцитов сахарозой при воздействии инфразвука. По оси ординат: величина гемолиза в относительных единицах, по оси абсцисс: частота ИЗ, Гц. 1) --- среда инкубации (контроль и опыт), 2) --- 0,3 М сахароза (контроль и опыт), 3) --- 0,4 М сахароза (контроль и опыт)
Гиперосмотический шок эритроцитов был моделирован 4 М раствором NaCl (рис. 3). В отличие от молекул сахарозы, молекула NaCl диссоциирует на ионы Na и Cl , которые могут проникать через плазматическую мембрану внутрь клетки [5]. Увеличение концентрации NaCl внутри эритроцитов ведет к набуханию, деформации и разрушению.
Рис. 3. Влияние инфразвука на ОРЭ при гиперосмотическом шоке (4М NaCl). По оси ординат: величина гемолиза в % от максимальной, вызванной 0,1 % раствором Na 2 СО 3. 1 -- среда инкубации, 2 -- 4М NaCl
Рис. 4. Влияние инфразвука разной частоты на перекисную резистентность эритроцитов. По оси абсцисс: Н2О2, мкл; по оси ординат : гемолиз , %
Как в среде инкубации, так и в 4М NaCl при частоте ИЗ 5, 7, 9 Гц зарегистрировано повышение величины гемолиза (на 8,1 %, 14,9 % и 13,4 % соответственно), а при воздействии ИЗ другими частотами – снижение величины гемолиза, причем значительное при частотах 3 и 11 Гц (на 42,6 % и 54,9 % соответственно).
Данные по определению перекисной резистентности эритроцитов контрольных проб донорской крови и проб крови при воздействии инфразвуком различной частоты кротковременной экспозиции представлены на рис. 4. Из рисунка видно, что резкое возрастание уровня гемолиза отмечается в начальной части кривой (при низких и средних концентрациях перекиси водорода) при частоте ИЗ 7 и 9 Гц, при высоких концентрациях Н2О2 наблюдается «плато» на уровне 78–82 % от 100 % гемолиза, вызванного 8 % раствором додецилсульфата натрия. Инфразвук частотой 5 и 13 Гц вызывает подобный эффект, только на более низком уровне. Частоты 3 и 11 Гц снижают уровень гемолиза по сравнению с контрольной пробой (при этом кривая повторяет контрольную). Следует обратить внимание, что частоты 1, 15 и 17 Гц практически полностью подавляют перекисный гемолиз эритроцитов при использованнии низких концентраций перекиси водорода и значительно снижают при высоких концентрациях Н2О2, тогда как гемолиз эритроцитов в контрольной пробе донорской крови с увеличением концентрации Н2О2 повышается на 40 %.
Выводы
По современным представлениям основной мишенью любого повреждающего фактора является плазматическая мембрана. В наших экспериментах воздействие инфразвука различной частоты даже кратковременной экспозиции (15 минут) на донорскую кровь обнаружило частотно- зависимые изменения рада свойств мембран эритроцитов (в том числе осмотической резистентности), проявляющихся в сдвигах проницаемости мембраны. В некоторых случаях проявлялись эффекты антигемолитического действия инфразвука, что может отражать скорее всего более глубокий характер изменений, сопровождающийся угнетением ферментативной активности или снижением проницаемости мембран.
Обобщая полученные данные, необходимо подчеркнуть, что выявляется четкая зависимость между изменением резистентности эритроцитов и частотой инфразвукового воздействия. В тоже время, сложный многофакторный характер причин, влияющих на проницаемость плазматической мембраны, требует сочетанного изучения нескольких лабораторных тестов для правильной оценки наблюдаемых сдвигов.
Тем не менее, полученные данные могут помочь раскрыть механизмы влияния инфразвука на организм, что имеет определенную практическую значимость.