Фитоэкдистероиды – гормоны линьки насекомых – являются перспективным классом биологически активных веществ (БАВ). Многие исследования подтвердили широкий спектр фармакологической активности данных веществ [1, 3, 5, 7]. При этом наличие стероидных соединений в растении является важным хемотаксономическим признаком семейства гвоздичные (Caryophyllaceae Juss.). Род ясколка (Сerastium L.), относящийся к подсемейству алсиновые (Alsinoideae), на сегодняшний день некоторыми исследователями причислен к родам, не содержащим в своем составе экдистероидов [3, 8]. Однако первое упоминание данного рода в числе экдистероидсодержащих представителей семейства гвоздичные было еще в 1996 г. [2]. В 2014 г. нами было установлено, что в траве ясколки полевой (С. arvense L.) содержится фитоэкдистероид экдистен (экдистерон). В качестве примера приводим результаты анализа высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (рис. 1, табл. 1). Также, методами ВЭЖХ и радиоиммунного анализа (РИА) небольшое содержание экдистероидов было недавно обнаружено в листьях ясколки костенцовой (C. holosteoides) [9].
Помимо фитоэкдистероидов для гвоздичных достаточно характерно наличие флавоноида виценина, представляющего собой 6,8-с-β-D-диглюкопиранозид апигенина и антоцианов [4].
Цель работы – провести анализ гербарных образцов ясколки (Сerastium L.) методом ТСХ на наличие фитоэкдистероидов и полифенольного соединения виценина, используя в качестве образцов-свидетелей спиртовые растворы виценина, полиподина В и экдистерона.
Рис. 1. Хроматограмма ВЭЖХ водно-спиртового извлечения ясколки полевой (С. arvense L.), детектирование при длине волны 254 нм
Таблица 1
Данные, полученные хроматограммой ВЭЖХ водно-спиртового извлечения ясколки полевой (детектирование при длине волны 254 нм)
|
№ п/п |
Время, мин |
Высота, mV |
Площадь, mV•с |
ФО |
Концентрация, % |
Название |
|
1 |
3,499 |
40,22 |
491,52 |
1,000 |
3,43 |
о-кумаровая кислота |
|
2 |
3,785 |
70,46 |
1129,05 |
1,000 |
7,89 |
аскорбиновая кислота |
|
3 |
4,04 |
51,55 |
395,79 |
1,000 |
2,76 |
таннин |
|
4 |
4,191 |
58,22 |
1372,24 |
1,000 |
9,59 |
галловая кислота |
|
5 |
4,587 |
36,75 |
417,41 |
1,000 |
2,92 |
ЭГКГаллат |
|
6 |
4,753 |
31,00 |
438,34 |
1,000 |
3,06 |
хлорогеновая кислота |
|
7 |
5,064 |
25,11 |
518,42 |
1,000 |
3,62 |
неизвестно |
|
8 |
5,508 |
19,04 |
350,81 |
1,000 |
2,45 |
эпикатехин |
|
9 |
5,796 |
18,94 |
336,87 |
1,000 |
2,35 |
неизвестно |
|
10 |
6,044 |
18,00 |
166,33 |
1,000 |
1,16 |
ванильная кислота |
|
11 |
6,357 |
24,40 |
806,20 |
1,000 |
5,63 |
цикориевая кислота |
|
12 |
6,971 |
14,31 |
389,78 |
1,000 |
2,72 |
кофейная кислота |
|
13 |
7,493 |
11,84 |
208,75 |
1,000 |
1,46 |
неохлорогеновая кислота |
|
14 |
7,865 |
13,46 |
429,20 |
1,000 |
3,00 |
неизвестно |
|
15 |
8,559 |
18,52 |
738,85 |
1,000 |
5,16 |
неизвестно |
|
16 |
9,562 |
11,03 |
644,28 |
1,000 |
4,50 |
дигидрокверцетин |
|
17 |
10,66 |
7,76 |
281,51 |
1,000 |
1,97 |
вератровая кислота |
|
18 |
11,39 |
12,07 |
526,04 |
1,000 |
3,67 |
феруловая кислота |
|
19 |
12,44 |
10,56 |
632,23 |
1,000 |
4,42 |
кумарин |
|
20 |
13,56 |
6,62 |
208,67 |
1,000 |
1,46 |
неизвестно |
|
21 |
14,35 |
13,26 |
407,00 |
1,000 |
2,84 |
лютеолин-7-гликозид |
|
22 |
14,87 |
17,50 |
829,94 |
1,000 |
5,80 |
неизвестно |
|
23 |
15,7 |
8,74 |
730,86 |
1,000 |
5,11 |
экдистен |
|
24 |
17,46 |
3,90 |
312,60 |
1,000 |
2,18 |
рутин |
|
25 |
19,71 |
2,81 |
221,96 |
1,000 |
1,55 |
неизвестно |
|
26 |
21,33 |
1,77 |
184,94 |
1,000 |
1,29 |
неизвестно |
|
27 |
23,47 |
6,39 |
543,42 |
1,000 |
3,80 |
неизвестно |
|
28 |
25,4 |
3,51 |
391,94 |
1,000 |
2,74 |
неизвестно |
|
29 |
29,05 |
0,44 |
27,27 |
1,000 |
0,19 |
неизвестно |
|
30 |
31,21 |
1,14 |
111,84 |
1,000 |
0,78 |
коричная кислота |
|
31 |
33,16 |
0,76 |
71,97 |
1,000 |
0,50 |
неизвестно |
|
31 |
55,27 |
560,07 |
14316,04 |
0,020 |
100,00 |
Таблица 2
Подроды и секции рода ясколки (Сerastium L.)
|
Подрод 1 Cerastium |
|
|
Секция 1 Caespitosa (Pax et K. Hoffm.) |
Cerastium caespitosum Gilib. |
|
Cerastium fontanum Baumg. |
|
|
Cerastium holosteoides Fr. |
|
|
Секция 2 Cerastium (Pax et K. Hoffm.) |
Cerastium alpinum L. |
|
Cerastium arvense L. |
|
|
Cerastium biebersteinii DC. |
|
|
Секция 3 Fugatia (Pax et K. Hoffm.) |
Cerastium glomeratum Thull. |
|
Cerastium glutinosum Fr. |
|
|
Подрод 2 Schizodon Fenzl |
|
|
Секция 4 Schizodon (Fenzl.) |
Cerastium dichotomium L. |
|
Секция 5 Strephodon (Ser.) |
Cerastium maximum L. |
|
Cerastium pauciflorum Steven ex Ser. |
|
|
Cerastium dahuricum Fisch. |
|
|
Cerastium perfoliatum L. |
|
Материалы и методы исследования
Некоторые виды (C. arvense, C. caespitosum) заготавливались на территории Рязанской области, остальные были получены из гербариев. Исследуемые растения были поделены на секции [6] (табл. 2).
Для проведения ТСХ-анализа на фитоэкдистероиды использовали пластинки «Silufol UV 240», в качестве системы применяли раствор хлороформ: спирт этиловый 4:1, 2:1. В качестве свидетелей использовали спиртовые растворы полиподина и экдистерона. Детектирование экдистероидов на хроматограммах проводили с помощью ванилинсерной кислоты. Исследование на виценин проводилось методом ТСХ на пластинках «Silufol UV 240», в качестве системы использовали бутанол: уксусная кислота: вода (БУВ) 4:1:2 соответственно. В качестве проявителя использовался спиртовой раствор цирконила нитрата основного 1 %.
Для получения извлечения около 0,2–0,5 г образцов растений помещали в пробирки и настаивали, используя в качестве растворителя спирт этиловый 40 % в течение 21 дня. После этого спиртовые извлечения с помощью микрокапилляров наносили на пластинки. Растворы свидетелей наносились таким же образом. После высушивания пластинки в течение 10 мин ее помещали в насыщенную парами системы камеру и ждали, пока фронт растворителя пройдет до конца пластинки, после чего пластинку высушивали в течение 20 мин. Высушенную пластинку просматривали сначала при дневном свете, затем обрабатывали ванилинсерной кислотой, при этом при дневном свете экдистероиды обнаруживались в виде зеленовато-бурых пятен различной интенсивности. После обработки парами аммиака в ультрафиолетовых лучах (УФ-лучах) при длине волны 240 нм экдистероиды приобретали голубой цвет с зеленоватым оттенком, а полиподин В флуоресцировал голубым цветом с лиловым оттенком.
При исследовании на виценин пластинку обрабатывали спиртовым раствором цирконила нитрата основного 1 %, после чего на хроматограмме при дневном освещении были отчетливо видны пятна от желтого до коричнево-бурого цвета в зависимости от концентрации его в извлечении, а в УФ-лучах пятна приобретали яркое оранжево-желтое окрашивание.
Таким образом, нами были получены несколько хроматограмм, в которых спиртовые экстракты растений были разделены по секциям (рис. 2, 3).
Результаты исследования и их обсуждение
На полученных хроматограммах (рис. 2, 3) можно обнаружить небольшие количества экдистероидов, по цвету пятен схожих с пятнами свидетелей. Так как в вытяжке из растения могут содержаться вещества, маскирующие цвет экдистероидов, после детектирования ванилинсерной кислотой мы обрабатывали пластинку парами аммиака, в которых пятна экдистероидов немного изменяли цвет. Таким образом, мы добивались снижения влияния маскирующих агентов. На хроматограммах можно было различить голубоватые пятна, характерные для экдистерона, и лиловато-бурые пятна полиподина.
Наиболее четко пятна экдистероидов на хроматограммах прослеживались в секциях Caespitosa (Pax et K. Hoffm.), Cerastium (Pax et K. Hoffm.), Strephodon (Ser.), при этом в секции № 2 количество экдистероидов по результатам эксперимента было самым высоким (визуальная оценка).
Результаты ТСХ исследования на виценин показали более явные результаты, где на хроматограммах всех секций были отчетливо видны пятна виценина. При этом наиболее яркие пятна имели извлечения растений секции № 2 Cerastium (Pax et K. Hoffm.), однако принадлежащий к ней вид C. alpinum в сравнении с остальными содержал небольшие количества виценина. Секция № 3 Fugatia (Pax et K. Hoffm.) также содержит растения, в которых виценина достаточно много, при этом C. glomeratum содержит большее количество вещества, чем C. glutinosum. В остальных секциях № 1 Caespitosa, № 4 Schizodon было обнаружено небольшое количество виценина в сравнении с остальными секциями, при этом наименее видимые пятна прослеживались в секции № 1. Секция № 5 содержит виценин во всех исследуемых образцах, однако его количество неодинаковое: максимальное у C. maximum и минимальное у C. dahuricum, остальные образцы содержат практически одинаковое количество вещества. Полученные результаты позволяют заключить, что дальнейшее изучение растений данного рода перспективно.
а
б
Рис. 2. Схема хроматограмм растений рода ясколка в системе хлороформ: спирт этиловый 2:1 (а), 4:1 (б). Обозначения: п – полиподин, э – экдистерон; секция № 1: 1 – С. fontanum; 2 – C. holosteoides; 3 – C. сaespitosum; секция № 2: 4 – С. alpinum; 5 – C. arvense; 6 – С. biebersteinii; секция № 3: 7 – С. glomeratum, 8 – C. glutinosum; секция № 4: 9 – С. dichotomium; секция № 5: 10 – С. perfoliatum; 11 – C. maximum; 12 – C. pauciflorum; 13 – C. dahuricum
Рис. 3. Схема хроматограмм растений рода ясколка, полученных в системе БУВ 4:1:2. Обозначения: в – виценин; секция № 1: 1 – C. сaespitosum; 2 – C. holosteoides; 3 – С. fontanum; секция № 2: 4 – С. alpinum; 5 – C. arvense; 6 – С. biebersteinii; 7 – С. glomeratum; 8 – C. glutinosum; 9 – С. dichotomium; 10 – C. maximum; 11 – C. pauciflorum; 12 – C. dahuricum; 13 – С. perfoliatum
Выводы
1. Нами установлено, что некоторые растения рода ясколки (Сerastium L.) семейства гвоздичные (Caryophyllaceae Juss.) содержат фитоэкдистероиды экдистерон и полиподин в небольших концентрациях, максимальное количество которых было обнаружено в секции № 2 Cerastium.
2. Исследуемые нами образцы растений рода во всех секциях имеют в своем составе виценин, наибольшее содержание которого наблюдалось в секции № 2 Cerastium.