В настоящее время в России вступила в действие фармакопея XIII, которая предусматривает селективное определение содержания тяжелых металлов в лекарственном растительном сырье (ЛРС) одним из современных инструментальных методов: атомно-абсорбционной спектрометрией, атомно-эмиссионной спектрометрией с индуктивно связанной плазмой (ИСП-АЭС) или масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой [6]. Эти методы характеризуются общим этапом подготовки, предусматривающим перевод образца в раствор с помощью различных смесей на основе концентрированной азотной кислоты и других сильнодействующих реагентов. Выбор методики пробоподготовки во многом зависит от определяемого элемента и его концентрации, а также от природы органической матрицы ЛРС. Нами была разработана методика микроволновой минерализации цветков ромашки, которая характеризуется большей простотой и безопасностью по сравнению с методиками пробоподготовки, используемыми в элементном анализе [7]. По степени извлечения тяжелых металлов из растительного сырья в раствор она сопоставима с методикой ЕРА [10]. Цель данной работы – валидация разработанной методики пробоподготовки с целью ее применения в фармакопейном анализе при контроле качества цветков ромашки аптечной по показателю «содержание тяжелых металлов». Детектирование и количественное определение тяжелых металлов осуществляли методом ИСП-АЭС.
Материалы и методы исследования
Валидацию методики проводили на цветках ромашки аптечной, в которые предварительно (за 1 месяц до минерализации пробы) добавляли известные количества стандартных образцов (СО) определяемых элементов производства фирмы Merck (CRM) c аттестованным значением СО 1000 мг/дм3 (валидационные образцы). Для каждого уровня концентраций определяемых элементов готовили 3 параллельных пробы. Цветки ромашки без добавления СО тяжелых металлов использовали для приготовления холостого раствора. Минерализацию проб проводили концентрированной азотной кислотой аналитической степени чистоты (For Trace Metal Analysis), производства Acros Organics с помощью микроволновой системы Anton Paar Multiwave 3000. Содержание тяжелых металлов измеряли на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно связанной плазмой Оptima 8300 DV фирмы Реrkin Elmer. Деионизованную воду, используемую при приготовлении испытуемых и стандартных растворов, получали на установке Milli-Q – Integral 3 фирмы Millipore, Франция.
Валидируемая методика
1,0 г (точная навеска) образца цветков ромашки, высушенных до постоянной массы при 105 °С в течение двух часов, растертых в однородный порошок и просеянных через сито с диаметром отверстий 1 мм, помещали в сосуд для микроволнового разложения и добавляли 8 см3 концентрированной азотной кислоты. При минерализации пробы использовали следующий временно-температурный режим: 0–80° (3 мин) → 80° (2 мин) → 80–165° (10 мин) → 165° (30 мин). Полученные после микроволнового разложения растворы охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через фильтр «синяя лента» в мерные колбы объемом 25 см3 и доводили до метки деионизованной водой. Измерение содержания определяемых элементов проводили методом стандартных добавок, путем сравнения эмиссии испытуемого раствора и эмиссии растворов с добавками элементов известной концентрации. Характеристические длины волн эмиссии (λ) по выбранным элементам представлены в табл. 1. В случае As и Cd за результат принимали среднее значение концентраций, полученных по результатам двух длин волн. Статистические характеристики валидационных параметров рассчитывали, используя программное обеспечение MS Excel 2007.
Результаты исследования и их обсуждение
Валидацию методики пробоподготовки при количественном определении тяжелых металлов в цветках ромашки аптечной проводили согласно требованиям к валидации методик анализа [1, 5, 8]. В круг определяемых тяжелых металлов включили мышьяк, свинец, ртуть и кадмий, содержание которых в ЛРС нормируется многими национальными и международными нормативными документами [3]. Была проведена оценка линейности, предела количественного определения, правильности и прецизионности валидируемой методики. Специфичность и диапазон применения валидируемой методики пробоподготовки не оценивали, так как эти параметры лимитируются выбранным методом детектирования (для ИСП-АЭС они представлены в нормативной и научной литературе [2, 4, 9]).
Линейность
При определении линейности изучали зависимость измеряемой на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно связанной плазмой интенсивности эмиссии элементов от содержания этих элементов в валидируемых образцах. Для оценки линейности проводили анализ серии из семи образцов цветков ромашки с прибавлением стандартных растворов тяжелых металлов с концентрациями 0,01; 0,02; 0,04; 0,08; 0,4; 0,8 и 1 мг/л (в рамках валидированной методики они соответствуют концентрациям 0,25; 0,5; 1; 2; 10; 20; 25 мг/кг элемента в образце). На основании полученных данных, представленных в табл. 1, были рассчитаны коэффициенты регрессионной прямой вида
y = bx + a,
где у – среднее значение измеренной на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно связанной плазмой интенсивности эмиссии определяемых элементов; х – значение содержания элемента в валидируемом образце.
Графики регрессионных прямых и статистические характеристики установленных линейных регрессий приведены на рисунке.
Таблица 1
Результаты оценки линейности валидируемой методики
|
Концентрация СО, мг/л |
Средняя величина эмиссии |
|||
|
As (188,979 и 197,197 нм) |
Cd (214,440 и 226,502 нм) |
Pb (220,353 нм) |
Hg (194,168 нм) |
|
|
0,01 |
25,8 |
1847,7 |
108,1 |
– |
|
0,02 |
39,3 |
3734,0 |
215,6 |
119,0 |
|
0,04 |
81,0 |
7333,4 |
349,6 |
231,3 |
|
0,08 |
158,7 |
14500,1 |
586,5 |
467,3 |
|
0,4 |
811,4 |
75110,9 |
3023,7 |
2229,7 |
|
0,8 |
1603,4 |
149206,3 |
5948,7 |
4643,1 |
|
1,0 |
1907,9 |
180213,9 |
7127,9 |
6038,1 |
Линейная зависимость интенсивности излучения (эмиссии) элементов от их концентрации в образце
В соответствии с требованиями [5] критерием приемлемости линейной зависимости является коэффициент корреляции r ≥ 0,990. Из рисунка следует, что валидируемая методика характеризуется приемлемой линейностью по всем определяемым элементам.
Предел количественного определения (ПКО)
При проведении элементного анализа образцов ЛРС величины ПКО заметно возрастают из-за матричных эффектов, поэтому их необходимо оценивать в рамках конкретной методики. За ПКО принимали минимальную концентрацию элемента, для которой величина отношения сигнал/шум составила около 10:1 [1, 5, 8]. Значения ПКО As, Cd, Hg, Pb составляют 0,01; 0,001; 0,02; 0,01 мг/л соответственно.
Правильность
Для оценки правильности валидируемой методики использовали результаты, полученные в ходе установления линейности. Все данные были проверены на наличие выбросов по критерию Граббса. В соответствии с требованиями [1, 8] для всех образцов рассчитывали коэффициент извлечения – отношение «найдено: введено» Zi (табл. 2), стандартное отклонение, коэффициент вариации (или rsd), доверительный интервал и систематическую погрешность (табл. 3).
Правильность валидируемой методики оценивали по двум критериям приемлемости:
1) доверительный интервал должен включать 100 % значение коэффициента извлечения [1];
2) систематическая погрешность не должна превышать свой доверительный интервал (критерий статистической незначимости) [8].
Как видно из данных табл. 3, оба требования для анализируемых элементов выполняются, следовательно, валидируемая методика характеризуется приемлемой правильностью.
Прецизионность
Прецизионность оценивали на уровнях сходимости и внутрилабораторной прецизионности по результатам трех определений для каждого из трех уровней концентраций элементов. Полученные в условиях сходимости и внутрилабораторной прецизионности результаты измерения отношения «найдено:внесено» (Zi) и их статистической обработки представлены в табл. 4 и 5 соответственно.
Таблица 2
Результаты оценки правильности валидируемой методики
|
№ п/п |
Введено |
Определяемый элемент |
|||||||
|
As |
Cd |
Pb |
Hg |
||||||
|
Найдено |
Z, % |
Найдено |
Z, % |
Найдено |
Z, % |
Найдено |
Z, % |
||
|
1 |
0,01 |
0,007 |
70,0 |
0,009 |
90,0 |
0,012 |
120,0 |
– |
– |
|
0,013 |
130,0 |
0,010 |
100,0 |
0,011 |
110,0 |
– |
– |
||
|
0,009 |
90,0 |
0,009 |
90,0 |
0,011 |
110,0 |
– |
– |
||
|
2 |
0,02 |
0,024 |
120,0 |
0,020 |
100,0 |
0,024 |
120,0 |
0,018 |
90,0 |
|
0,020 |
100,0 |
0,021 |
105,0 |
0,022 |
110,0 |
0,016 |
80,0 |
||
|
0,020 |
100,0 |
0,020 |
100,0 |
0,023 |
115,0 |
0,017 |
85,0 |
||
|
3 |
0,04 |
0,037 |
92,5 |
0,041 |
102,5 |
0,046 |
115,0 |
0,040 |
100,0 |
|
0,042 |
105,0 |
0,040 |
100,0 |
0,047 |
117,5 |
0,037 |
92,5 |
||
|
0,044 |
110,0 |
0,041 |
102,5 |
0,044 |
110,0 |
0,035 |
87,5 |
||
|
4 |
0,08 |
0,088 |
110,0 |
0,078 |
97,5 |
0,081 |
101,3 |
0,078 |
97,5 |
|
0,084 |
105,0 |
0,080 |
100,0 |
0,085 |
106,3 |
0,079 |
98,8 |
||
|
0,082 |
103,0 |
0,081 |
101,3 |
0,073 |
91,3 |
0,079 |
98,8 |
||
|
5 |
0,4 |
0,370 |
92,5 |
0,386 |
96,5 |
0,377 |
94,3 |
0,396 |
99,0 |
|
0,354 |
88,5 |
0,399 |
99,8 |
0,375 |
93,8 |
0,378 |
94,5 |
||
|
0,373 |
93,3 |
0,380 |
95,0 |
0,386 |
96,5 |
0,388 |
97,0 |
||
|
6 |
0,8 |
0,705 |
88,1 |
0,729 |
101,1 |
0,727 |
90,8 |
0,815 |
101,9 |
|
0,734 |
91,8 |
0,790 |
98,8 |
0,793 |
99,1 |
0,816 |
102,0 |
||
|
0,745 |
93,1 |
0,778 |
97,2 |
0,776 |
97,0 |
0,799 |
99,9 |
||
|
7 |
1,0 |
0,886 |
88,6 |
0,921 |
92,1 |
0,895 |
89,5 |
1,027 |
102,7 |
|
0,897 |
89,7 |
0,938 |
103,8 |
0,942 |
94,2 |
1,041 |
104,1 |
||
|
0,899 |
89,9 |
0,941 |
94,1 |
0,942 |
94,2 |
1,065 |
106,5 |
||
Таблица 3
Статистические характеристики правильности валидируемой методики
|
Статистическая характеристика |
Определяемый элемент |
|||
|
As |
Cd |
Pb |
Hg |
|
|
Среднее значение Z, % |
97,7 |
98,4 |
103,6 |
96,5 |
|
Cистематическая погрешность δ = (Z – 100), % |
2,3 |
1,6 |
3,6 |
3,5 |
|
Cтандартное отклонение, % |
12,9 |
4,2 |
10,4 |
7,1 |
|
Коэффициент вариации, % |
13,2 |
4,3 |
10,0 |
7,3 |
|
Доверительный интервал (Р = 95 %), % |
97,7 ± 5,9 |
98,4 ± 1,9 |
103,6 ± 4,7 |
96,5 ± 3,5 |
Таблица 4
Результаты исследования сходимости и внутрилабораторной прецизионности методики
|
Внесено, мг/л |
0,02 |
0,4 |
1,0 |
||||||||
|
Параллельные измерения |
1 |
2 |
3 |
1 |
2 |
3 |
1 |
2 |
3 |
||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
Оператор 1 |
As |
найдено |
0,024 |
0,020 |
0,021 |
0,370 |
0,354 |
0,373 |
0,886 |
0,897 |
0,899 |
|
Zi, % |
120,0 |
100,0 |
105,0 |
92,5 |
88,5 |
93,3 |
88,6 |
89,7 |
89,9 |
||
|
Cd |
найдено |
0,020 |
0,021 |
0,020 |
0,386 |
0,399 |
0,380 |
0,921 |
0,938 |
0,941 |
|
|
Zi, % |
100,0 |
105,0 |
100,0 |
96,5 |
99,8 |
95,0 |
92,1 |
103,8 |
94,1 |
||
|
Pb |
найдено |
0,024 |
0,022 |
0,023 |
0,377 |
0,375 |
0,386 |
0,895 |
0,942 |
0,942 |
|
|
Zi, % |
120,0 |
110,0 |
115,0 |
94,3 |
93,8 |
96,5 |
89,5 |
94,2 |
94,2 |
||
|
Hg |
найдено |
0,020 |
0,016 |
0,017 |
0,396 |
0,378 |
0,388 |
1,027 |
1,041 |
1,095 |
|
|
Zi, % |
100,0 |
80,0 |
85,0 |
99,0 |
94,5 |
97,0 |
102,7 |
104,1 |
109,5 |
||
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
|
Оператор 2 |
As |
найдено |
0,024 |
0,022 |
0,020 |
0,360 |
0,355 |
0,375 |
0,900 |
0,915 |
0,895 |
|
Zi, % |
120,0 |
110,0 |
100,0 |
90,0 |
88,8 |
93,8 |
90,0 |
91,5 |
89,5 |
||
|
Cd |
найдено |
0,020 |
0,020 |
0,020 |
0,380 |
0,396 |
0,395 |
0,920 |
0,941 |
0,935 |
|
|
Zi, % |
100,0 |
100,0 |
100,0 |
95,0 |
99,0 |
98,8 |
92,0 |
94,1 |
93,5 |
||
|
Pb |
найдено |
0,021 |
0,022 |
0,020 |
0,380 |
0,386 |
0,387 |
0,895 |
0,950 |
0,947 |
|
|
Zi, % |
105,0 |
110,0 |
100,0 |
95,0 |
96,5 |
96,8 |
89,5 |
95,0 |
94,7 |
||
|
Hg |
найдено |
0,020 |
0,017 |
0,017 |
0,391 |
0,386 |
0,375 |
1,021 |
1,020 |
1,044 |
|
|
Zi, % |
100,0 |
85,0 |
85,0 |
97,8 |
96,5 |
93,8 |
102,1 |
102,0 |
104,4 |
||
Таблица 5
Статистические характеристики сходимости и внутрилабораторной прецизионности валидируемой методики
|
Показатель |
Оператор 1 |
Оператор 2 |
||||||
|
As |
Cd |
Pb |
Hg |
As |
Cd |
Pb |
Hg |
|
|
Среднее Zi, % |
96,4 |
98,5 |
100,8 |
96,9 |
97,1 |
96,9 |
98,1 |
96,3 |
|
Стандартное отклонение, % |
10,5 |
4,4 |
11,1 |
9,3 |
11,0 |
3,2 |
6,1 |
7,2 |
|
Коэффициент вариации, % |
10,9 |
4,4 |
11,0 |
9,6 |
11,3 |
3,3 |
6,3 |
7,4 |
|
Доверит. интервал (Р = 95 %), % |
± 8,1 |
± 3,4 |
± 8,5 |
± 7,1 |
± 2,5 |
± 2,5 |
± 4,7 |
± 5,5 |
|
Объединенное среднее значение Zi, % As 96,8 Cd 97,7 Pb 99,5 Hg 96,6 |
||||||||
|
Объединенное стандартное отклонение, % * As 10,7 Cd 3,8 Pb 9,4 Hg 8,3 |
||||||||
|
Объединенный коэффициент вариации, % As 11,1 Cd 3,9 Pb 9,4 Hg 8,6 |
||||||||
|
Объединенный доверительный интервал, % As 7,6 Cd 2,7 Pb 7,4 Hg 5,9 |
||||||||
|
F-критерий Фишера |
As Fтабл = 3,44; Fфакт = 1,10 Cd Fтабл = 3,44; Fфакт = 1,83 Pb Fтабл = 3,44; Fфакт = 3,28 Hg Fтабл = 3,44; Fфакт = 1,69 |
|||||||
|
t-критерий Стьюдента |
As tтабл = 2,12; tфакт = 0,13 Cd tтабл = 2,12; tфакт = 0,85 Pb tтабл = 2,12; tфакт = 0,31 Hg tтабл = 2,12; tфакт = 0,15 |
|||||||
Примечание. *объединенные значения стандартного отклонения, коэффициента вариации и доверительного интервала с учетом данных двух операторов рассчитаны в соответствии с требованиями [8].
Статистические характеристики сходимости и внутрилабораторной прецизионности валидируемой методики представлены в табл. 5.
В случае оценки приемлемости внутрилабораторной прецизионности нормативные и методические документы в сфере GMP [1] рекомендуют рассчитывать статистические критерии Фишера (F) и Стьюдента (t) и сравнивать фактические значения tфакт и Fфакт с табличными – максимальными значениями критериев под влиянием случайных факторов при текущих степенях свободы и при заданном уровне значимости (tтабл и Fтабл). Как следует из данных табл. 5, табличные значения F и t превосходят фактические значения для всех определяемых элементов, что свидетельствует о статистической незначимости различий между средними значениями и стандартными отклонениями результатов измерений двух операторов при уровне значимости 95 %.
Таким образом, методика пробоподготовки при количественном определении тяжелых металлов в цветках ромашки аптечной методом ИСП-АЭС была оценена по основным валидационным параметрам, что доказывает возможность ее применения в фармакопейном анализе при контроле качества цветков ромашки аптечной по показателю «содержание тяжелых металлов».