Научный журнал

Успехи современного естествознания

ISSN 1681-7494

"Перечень" ВАК

ИФ РИНЦ = 0,775

• Авторы
• Резюме
• Файлы
• Ключевые слова
• Литература

Щукин В.М. 1 Северинова Е.Ю. 1 Кузьмина Н.Е. 1 Яшкир В.А. 1 Меркулов В.А. 1

---

1 ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России

В работе описана процедура валидации методики микроволновой кислотной минерализации цветков ромашки аптечной. Данная методика пробоподготовки обеспечивает максимальный переход тяжелых металлов в раствор при неполном разложении органической матрицы с помощью концентрированной азотной кислоты. Детектирование и количественное определение тяжелых металлов осуществляли методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой ИСП-АЭС. На основании полученных экспериментальных данных была проведена оценка линейности, предела количественного определения, правильности, сходимости и внутрилабораторной прецизионности валидируемой методики. На основе измеренных коэффициентов извлечения мышьяка, свинца, ртути и кадмия были рассчитаны стандартные отклонения, коэффициенты вариации, доверительные интервалы, систематические погрешности, F-критерии Фишера и t-критерии Стьюдента. Показано, что полученные статистические характеристики удовлетворяют критериям приемлемости валидационных параметров, представленным в отечественной и зарубежной нормативной документации.

Статья в формате PDF

0 KB

ромашка аптечная

метод атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой

микроволновая минерализация

тяжелые металлы

валидация аналитической методики

линейность

правильность

сходимость

прецизионность

предел количественного определения

1. Береговых В.В. (ред.). Валидация аналитических методик для производителей лекарств // Типовое руководство предприятия по производству лекарственных средств. М.: Литерра, 2008. – C. 12–114.

2. Забокрицкий М.П., Сабуров В.В. Критерии выбора спектрального метода применительно к анализу микроэлементов в биологических объектах // Микроэлементы в медицине. – 2014. – Т. 15, № 4. – С. 29–38.

3. Кузьмина Н.Е., Щукин В.М., Северинова Е.Ю., Яшкир В.А., Меркулов В.А. Изменение подходов к нормированию содержания тяжелых металлов в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах // Хим.-фарм. ж. – 2015. – Т. 49, № 7. – С. 52–56.

4. МУК 4.1.1.1482–03 от 29.06.2003 г. Методические указания. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, поливитаминных препаратах с микроэлементами, в биологически активных добавках к пище и в сырье для их изготовления методом атомной эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой. – URL: http://www/lawrussia.ru/texts/legal_490/doc490a997x620.htm (дата обращения: 24.06.16).

5. ОФС 1.1.0012.15 Валидация аналитических методик // ГФ РФ XIII. – URL: http://femb.ru/feml. (дата обращения: 04.02.16).

6. ОФС 1.5.3.0009.15 Определение содержания тяжелых металлов и мышьяка в лекарственном растительном сырье и лекарственных растительных препаратах // ГФ РФ XIII. – URL: http://femb.ru/feml. (дата обращения: 04.02.16).

7. Щукин В.М., Северинова Е.Ю., Кузьмина Н.Е., Яшкир В.А., Меркулов В.А. Усовершенствование методики пробоподготовки при количественном определении тяжелых металлов в цветках ромашки аптечной (matricaria chamomilla) методом ИСП-АЭС // Успехи современного естествознания. – 2016. – № 6. – C. 53–58.

8. Юргель Н.В. (ред.). Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств (методические рекомендации). – М.: Спорт и культура – 2000, 2007. – C. 14–74.

9. NIST Atomic Spectra Database Lines Form. – URL: http://physics.nist.gov/PhysRefData/ASD/lines_form.html (дата обращения: 04.08.16).

10. United States Environmental Protection Agency SW-846 Test Method 3052: Microwave assisted acid digestion of siliceous and organically based matrices. – URL: https://www.epa.gov/sites/production/files/2015-12/documents/3052.pdf (дата обращения: 08.04.16).

В настоящее время в России вступила в действие фармакопея XIII, которая предусматривает селективное определение содержания тяжелых металлов в лекарственном растительном сырье (ЛРС) одним из современных инструментальных методов: атомно-абсорбционной спектрометрией, атомно-эмиссионной спектрометрией с индуктивно связанной плазмой (ИСП-АЭС) или масс-спектрометрией с индуктивно связанной плазмой [6]. Эти методы характеризуются общим этапом подготовки, предусматривающим перевод образца в раствор с помощью различных смесей на основе концентрированной азотной кислоты и других сильнодействующих реагентов. Выбор методики пробоподготовки во многом зависит от определяемого элемента и его концентрации, а также от природы органической матрицы ЛРС. Нами была разработана методика микроволновой минерализации цветков ромашки, которая характеризуется большей простотой и безопасностью по сравнению с методиками пробоподготовки, используемыми в элементном анализе [7]. По степени извлечения тяжелых металлов из растительного сырья в раствор она сопоставима с методикой ЕРА [10]. Цель данной работы – валидация разработанной методики пробоподготовки с целью ее применения в фармакопейном анализе при контроле качества цветков ромашки аптечной по показателю «содержание тяжелых металлов». Детектирование и количественное определение тяжелых металлов осуществляли методом ИСП-АЭС.

Материалы и методы исследования

Валидацию методики проводили на цветках ромашки аптечной, в которые предварительно (за 1 месяц до минерализации пробы) добавляли известные количества стандартных образцов (СО) определяемых элементов производства фирмы Merck (CRM) c аттестованным значением СО 1000 мг/дм3 (валидационные образцы). Для каждого уровня концентраций определяемых элементов готовили 3 параллельных пробы. Цветки ромашки без добавления СО тяжелых металлов использовали для приготовления холостого раствора. Минерализацию проб проводили концентрированной азотной кислотой аналитической степени чистоты (For Trace Metal Analysis), производства Acros Organics с помощью микроволновой системы Anton Paar Multiwave 3000. Содержание тяжелых металлов измеряли на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно связанной плазмой Оptima 8300 DV фирмы Реrkin Elmer. Деионизованную воду, используемую при приготовлении испытуемых и стандартных растворов, получали на установке Milli-Q – Integral 3 фирмы Millipore, Франция.

Валидируемая методика

1,0 г (точная навеска) образца цветков ромашки, высушенных до постоянной массы при 105 °С в течение двух часов, растертых в однородный порошок и просеянных через сито с диаметром отверстий 1 мм, помещали в сосуд для микроволнового разложения и добавляли 8 см3 концентрированной азотной кислоты. При минерализации пробы использовали следующий временно-температурный режим: 0–80° (3 мин) → 80° (2 мин) → 80–165° (10 мин) → 165° (30 мин). Полученные после микроволнового разложения растворы охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через фильтр «синяя лента» в мерные колбы объемом 25 см3 и доводили до метки деионизованной водой. Измерение содержания определяемых элементов проводили методом стандартных добавок, путем сравнения эмиссии испытуемого раствора и эмиссии растворов с добавками элементов известной концентрации. Характеристические длины волн эмиссии (λ) по выбранным элементам представлены в табл. 1. В случае As и Cd за результат принимали среднее значение концентраций, полученных по результатам двух длин волн. Статистические характеристики валидационных параметров рассчитывали, используя программное обеспечение MS Excel 2007.

Результаты исследования и их обсуждение

Валидацию методики пробоподготовки при количественном определении тяжелых металлов в цветках ромашки аптечной проводили согласно требованиям к валидации методик анализа [1, 5, 8]. В круг определяемых тяжелых металлов включили мышьяк, свинец, ртуть и кадмий, содержание которых в ЛРС нормируется многими национальными и международными нормативными документами [3]. Была проведена оценка линейности, предела количественного определения, правильности и прецизионности валидируемой методики. Специфичность и диапазон применения валидируемой методики пробоподготовки не оценивали, так как эти параметры лимитируются выбранным методом детектирования (для ИСП-АЭС они представлены в нормативной и научной литературе [2, 4, 9]).

Линейность

При определении линейности изучали зависимость измеряемой на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно связанной плазмой интенсивности эмиссии элементов от содержания этих элементов в валидируемых образцах. Для оценки линейности проводили анализ серии из семи образцов цветков ромашки с прибавлением стандартных растворов тяжелых металлов с концентрациями 0,01; 0,02; 0,04; 0,08; 0,4; 0,8 и 1 мг/л (в рамках валидированной методики они соответствуют концентрациям 0,25; 0,5; 1; 2; 10; 20; 25 мг/кг элемента в образце). На основании полученных данных, представленных в табл. 1, были рассчитаны коэффициенты регрессионной прямой вида

y = bx + a,

где у – среднее значение измеренной на атомно-эмиссионном спектрометре с индуктивно связанной плазмой интенсивности эмиссии определяемых элементов; х – значение содержания элемента в валидируемом образце.

Графики регрессионных прямых и статистические характеристики установленных линейных регрессий приведены на рисунке.

Таблица 1

Результаты оценки линейности валидируемой методики

Линейная зависимость интенсивности излучения (эмиссии) элементов от их концентрации в образце

В соответствии с требованиями [5] критерием приемлемости линейной зависимости является коэффициент корреляции r ≥ 0,990. Из рисунка следует, что валидируемая методика характеризуется приемлемой линейностью по всем определяемым элементам.

Предел количественного определения (ПКО)

При проведении элементного анализа образцов ЛРС величины ПКО заметно возрастают из-за матричных эффектов, поэтому их необходимо оценивать в рамках конкретной методики. За ПКО принимали минимальную концентрацию элемента, для которой величина отношения сигнал/шум составила около 10:1 [1, 5, 8]. Значения ПКО As, Cd, Hg, Pb составляют 0,01; 0,001; 0,02; 0,01 мг/л соответственно.

Правильность

Для оценки правильности валидируемой методики использовали результаты, полученные в ходе установления линейности. Все данные были проверены на наличие выбросов по критерию Граббса. В соответствии с требованиями [1, 8] для всех образцов рассчитывали коэффициент извлечения – отношение «найдено: введено» Zi (табл. 2), стандартное отклонение, коэффициент вариации (или rsd), доверительный интервал и систематическую погрешность (табл. 3).

Правильность валидируемой методики оценивали по двум критериям приемлемости:

1) доверительный интервал должен включать 100 % значение коэффициента извлечения [1];

2) систематическая погрешность не должна превышать свой доверительный интервал (критерий статистической незначимости) [8].

Как видно из данных табл. 3, оба требования для анализируемых элементов выполняются, следовательно, валидируемая методика характеризуется приемлемой правильностью.

Прецизионность

Прецизионность оценивали на уровнях сходимости и внутрилабораторной прецизионности по результатам трех определений для каждого из трех уровней концентраций элементов. Полученные в условиях сходимости и внутрилабораторной прецизионности результаты измерения отношения «найдено:внесено» (Zi) и их статистической обработки представлены в табл. 4 и 5 соответственно.

Таблица 2

Результаты оценки правильности валидируемой методики

Таблица 3

Статистические характеристики правильности валидируемой методики

Таблица 4

Результаты исследования сходимости и внутрилабораторной прецизионности методики

Таблица 5

Статистические характеристики сходимости и внутрилабораторной прецизионности валидируемой методики

Примечание. *объединенные значения стандартного отклонения, коэффициента вариации и доверительного интервала с учетом данных двух операторов рассчитаны в соответствии с требованиями [8].

Статистические характеристики сходимости и внутрилабораторной прецизионности валидируемой методики представлены в табл. 5.

В случае оценки приемлемости внутрилабораторной прецизионности нормативные и методические документы в сфере GMP [1] рекомендуют рассчитывать статистические критерии Фишера (F) и Стьюдента (t) и сравнивать фактические значения tфакт и Fфакт с табличными – максимальными значениями критериев под влиянием случайных факторов при текущих степенях свободы и при заданном уровне значимости (tтабл и Fтабл). Как следует из данных табл. 5, табличные значения F и t превосходят фактические значения для всех определяемых элементов, что свидетельствует о статистической незначимости различий между средними значениями и стандартными отклонениями результатов измерений двух операторов при уровне значимости 95 %.

Таким образом, методика пробоподготовки при количественном определении тяжелых металлов в цветках ромашки аптечной методом ИСП-АЭС была оценена по основным валидационным параметрам, что доказывает возможность ее применения в фармакопейном анализе при контроле качества цветков ромашки аптечной по показателю «содержание тяжелых металлов».

Библиографическая ссылка