Научный журнал
Успехи современного естествознания
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,775

ЭКСПРЕССИЯ ε-ГЕНА ЭМБРИОНАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНА ПРИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ

Кривенцев Ю.А. Никулина Д.М. Бисалиева Р.А. Борисова Н.В. Бисалиев Р.В.

Гемоглобины человека изучаются уже на протяжении почти века, но, тем не менее, эмбриональный гемоглобин (HbP, синоним - HbE) является одним из самых малоизученных белков человеческого организма. Сведения о HbP в научной литературе до сих пор крайне скудны. Такой парадоксально низкий интерес ученых к этому белку можно объяснить следующими причинами: а) методологический фактор: получение препарата HbP крайне затруднительно из-за сложностей получения биоматериала (HbP синтезируется только в раннем эмбриогенезе, с 5 по 18 гестации), экстрагирования и очистки белка; б) практический фактор: по мнению большинства клиницистов, данный белок не представляет прикладной (диагностическо-прогностической) ценности, т.к. активность его гена полностью репрессирована как у детей, так и у взрослых [1, 2, 3, 6].

В данной работе авторы исходили из предположения, что активация ε-гена HbP в постнатальном периоде жизни человека возможна при патологии, связанной с понижением степени дифференцировки, т.н. «омоложением» клеток эритроцитарного ростка [4]. К таким состояниям можно отнести некоторые онкологические заболевания тканей красного костного мозга, в первую очередь, эритремии, сублейкемические миелозы, а также, возможно, некоторые миелолейкозы.

Цель исследования - иммунохимический качественный анализ наличия эмбрионального гемоглобина в эритроцитах больных эритромами, сублейкемическими миелозами и лейкозами различных типов.

В процессе научно-экспериментального исследования физико-химических свойств эмбрионального гемоглобина авторами разработан оптимальный алгоритм выделения этого белка [4].

Исходным биоматериалом для выделения и очистки HbP служил абортивный материал сроком 7-9 недель (отделение неонатологии больницы №5 г. Астрахани). После промывки и сортировки эмбриональные ткани подвергались механически-термической гомогенизации. После экстрагирования цитозольных белков проводили, взвесь центрифугировали при 8000 g в течение 30 мин, после чего осадок отбрасывали. Поскольку устойчивость эмбрионального гемоглобина несколько ниже, чем у фетального [6], для очистки HbP нами была модифицирована стандартная методика щелочной денатурации для выделения фетального гемоглобина [3, 6], состоящая в 40-секундной обработке смеси 1,2 М раствором NaOH, с последовательным осаждением белков раствором сульфата аммония (до 50%-й насыщенности). После центрифугирования при 8000 об/мин в течение 30 мин осадок отделяли. В надосадочной жидкости оставался эмбриональный гемоглобин с незначительным количеством белковых примесей. Полученный белковый препарат подвергали обессоливанию путем гель-проникающей хроматографии на колонке с сефадексом G-25, рабочий буфер - 0,05 М фосфатный буферный раствор рН 7,4. Окончательную очистку HbP от оставшихся щелочеустойчивых компонентов в полученном на предыдущем этапе препарате проводили путем ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе G-50 на 0,01 М трис-хлоридном буфере рН 8,1 в градиенте ионной силы.

Анализ чистоты полученных препаратов осуществляли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле.

Полученные очищенные препараты HbP использовали, в частности, для получения специфических антисывороток на данный белок методом иммунизации кроликов. Иммунизация проводилась с полным адьювантом Фрейнда по стандартной методике [5]. Для контроля качества антисывороток проводили их иммунохимическое сопоставление с другими антигенными композитами, а также специфическую окраску полученных преципитатов бензидиновым методом [6]. При наличии дополнительных линий преципитации проводили дробное истощение антисыворотки соответствующей белковой фракцией. В результате проведенной работы разработаны специфические иммунохимические тест-системы на эмбриональный гемоглобин, в которой тест-антигеном является очищенный препарат HbР (полученный вышеописанным способом) в рабочем разведении: 1/2 или экстракт тканей эмбриона (срок - 6-9 недель) в рабочем разведении 1/8-1/16. Тест-системы на использовали для иммунохимической индикации HbP в исследуемом материале.

Объектом нашего исследования являлась гепаринизированная кровь больных некоторыми гематологическими онкозаболеваниями. Всего было обследовано 107 образцов крови. Из них: 12 больных эритромами, 11 больных сублейкемическими миелозами, 31 больных острыми и хроническими миелолейкозами, 17 больных острыми и хроническими лимфолейкозами, а также 36 образцов крови здоровых людей (группа контроля) (табл.1).

Сбор биоматериала проводили в гематологическом отделении 1-й областной больницы г. Астрахань.

Подготовка проб к анализу состояла в их предварительном гемолизе путем двухкратного замораживания (при -180С) и оттаивания.

Таблица 1 Перечень использованного в работе материала

Исследуемый материал (кровь)

Количество проб

Здоровые

36

Больные эритремиями

12

Больные сублейкемическими миелозами

11

Больные хроническими миелолейкозами

22

Больные острыми миелолейкозами

9

Больные острыми и хроническими лимфолейкозами

17

ВСЕГО

107

Индикация HbP в образцах осуществлялась путем иммунодиффузии по Оучтерлони [5]. В ходе работы использовались моновалентные иммунохимические тест-системы на HbP (см. выше).

После иммунопроявления агаровые стекла высушивали и подвергали специфическому окрашиванию на гемоглобины гваяколовым методом, модифицированным авторами: 0,2 г гваякола в 50 мл ледяной уксусной кислоты, затем добавляли этот раствор в 0,1М ацетатный буфер рН 4,6 с 0,2% хлоридом марганца (II) до 0,3% концентрации. Туда же добавляли перекись водорода до концентрации 1%. Экспозиция 45 мин. В результате окраски гемоглобиновые преципитаты приобретали голубой цвет.

Стекла фотографировали в отраженно-рассеянном свете. Считывание результатов проводили только по отчетливым окрашенным линиям преципитации.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием статистических компьютерных программ.

В результате проведенного иммунохимического анализа исследуемого материала на эмбриональный гемоглобин методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони получены следующие результаты (табл. 2).

Как видно из приведенных данных, эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эритремиями, хроническими эритромиелозами, сублейкемическими миелозами и острыми миелолейкозами. Эти данные свидетельствуют о возможности дерепрессии гена ε-протомера (гена эмбрионального гемоглобина) при снижении дифференцировки клеток эритроцитарного ростка, сопровождающей онкологические заболевания данной ткани. Нулевая выявляемость HbP в крови гематологических больных с онкопатологией неэритроидного генеза (острые и хронические лимфолейкозы) согласуется с приведенной версией.

Таблица 2 Результаты иммунохимической индикации HbP в крови онко-гематологических больных

Исследуемый материал

Количество проб

Количество положительных результатов на HbP

Процент положительных результатов на HbP

Здоровые

36

0

0,0

Больные эритремиями

12

8

66,67

Больные сублейкеми-ческими миелозами

11

4

36,36

Больные хроническими миелолейкозами

22

1

4,55

Больные острыми миелолейкозами

9

2

22,22

Больные острыми и хроническими лимфолейкозами

17

0

0,0

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что иммунохимическая индикация эмбрионального гемоглобина в крови гематологических больных способствует повышению качества дифференциальной диагностики ряда онко-гематологических заболеваний.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

  1. Гипоксия. Адаптация, патогенез, клиника. - СПб, ООО "ЭЛБИ-СПб", 2000. - 384 с.
  2. Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы патохимии - СПб. «Элби-СПб». - 2000. - 182 с.
  3. Карпищенко А.И. - Медицинские лабораторные технологии и диагностика / А.И. Карпищенко. - Справочник, т 1, С. Петербург, 1998. - 144 с.
  4. Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Семенова Т.Б. - Иммунохимический анализ продукции эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Волгоград-Москва. - 2006. - С.58-62.
  5. Никулина Д.М. - Практическое освоение иммунохимических методов / Метод. рекомендации. - Астрахань, - 1996. - 36 с.
  6. Стародуб Н.Ф., Назаренко В.И. - Гетерогенная система гемоглобина: структура, свойства, синтез, биологическая роль / АН УССР, Институт молекулярной биологии и генетики. Киев: Наукова думка, 1987. - 198 с.

Библиографическая ссылка

Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Борисова Н.В., Бисалиев Р.В. ЭКСПРЕССИЯ ε-ГЕНА ЭМБРИОНАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНА ПРИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ // Успехи современного естествознания. – 2007. – № 1. – С. 72-74;
URL: https://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=10865 (дата обращения: 29.03.2024).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1,674