Научный журнал
Успехи современного естествознания
ISSN 1681-7494
"Перечень" ВАК
ИФ РИНЦ = 0,791

ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ КУЛЬТУРЫ АЦИДОФИЛЬНЫХ ХЕМОЛИТОТРОФОВ, АДАПТИРОВАННЫХ К ВЫСОКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ КОБАЛЬТА

Хомченкова А.С. 1
1 ФГБУН «Научно-исследовательский геотехнологический центр» Дальневосточного отделения Российской академии наук
В последние двадцать лет проявляется всё больший интерес к исследованиям взаимодействий микроорганизмов с металлами. Существует множество вариантов металл-микробных отношений, но из-за их сложности многие из этих механизмов всё еще изучаются. Исследуя метаболические стратегии микробного противостояния токсическому воздействию металлов, человек может создать улучшенные штаммы микроорганизмов и использовать их в биотехнологии при добыче ценных компонентов из руд и отходов горной промышленности. В технологии бактериально-химического выщелачивания (БХВ) используют сообщества микроорганизмов, эволюционно приспособленных к присутствию металлов во внешней среде. Но концентрации металлов в пульпах выщелачивания способны угнетать метаболизм даже устойчивых штаммов, в связи с этим необходимо проводить адаптацию микробных сообществ, а также осуществлять подбор штаммов перед их использованием в промышленных условиях. Статья описывает опыт адаптации смешанной культуры ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов (в её составе идентифицированы Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus spp.), полученных из сульфидной кобальт-медно-никелевой руды месторождения Шануч (Камчатский край, Россия), к высоким концентрациям ионов кобальта (12, 14, 16, 18, 20 г/л) в питательной среде 9 К с железом; рост культуры сохранялся при всех вариантах концентраций кобальта, превышая показатели роста в контроле (в среде без ионов кобальта). Наблюдение за таким важным фактором жизнедеятельности микроорганизменного сообщества, как окислительная активность, провели для образца, адаптированного к 20 г/л ионов кобальта. Скорость окисления железа адаптированной культурой была приблизительно в два раза выше, чем контрольной.
хемолитотрофные микроорганизмы
кобальт
окисление железа
устойчивость
бактериально-химическое выщелачивание
сульфидные руды
1. Das S., Dash H. R. Handbook of Metal-microbe Interactions and Bioremediation. CRC Press, 2017. 813 р.
2. Хомченкова А.С. Исследование влияния различных концентраций солей тяжелых металлов на рост культуры ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов // Горный информационно-аналитический бюллетень. 2016. № S31. С. 217–222.
Khomchenkova A.S. Study of effect of various concentration salts of heavy metals on growth acidophilic chemolithotrophic microorganisms crop // Mining informational and analytical bulletin. 2016. № S31. P. 217–222 (in Russian).
3. Abhilash, Pandey B.D., Natarajan K.A. Microbiology for minerals, metals, materials and the environment. CRC Press, 2015. 590 р.
4. Хомченкова А.С. Тяжелые металлы и выщелачивающие микроорганизмы (обзор) // Горный информационно-аналитический бюллетень. 2017. № S12. С. 228–236. DOI: 10.25018/0236-1493-2017-12-32-228-236.
Khomchenkova A.S. The heavy metals and leaching microorganisms (a review) // Mining informational and analytical bulletin. 2017. № S32. P. 228–236 (in Russian).
5. Norris P.R., Burton N.P., Foulis N.A. Acidophiles in bioreactor mineral processing. Extremophiles. 2000. Vol. 4. № 2. P. 71–76.
6. Каравайко Г.И., Росси Дж., Агате А. и др. Биогеотехнология металлов. Практическое руководство. М.: Центр международных проектов ГКНТ, 1989. 375 с.
Karavaiko G.I., Rossi J., Agate A. et al. Biogeotechnology of metals. M.: Centr mezhdunarodnikh proektov GKNT, 1989. 375 p. (in Russian).

Помимо антропогенного внесения, металлы присутствуют в природных средах в постоянном фоновом количестве. Микроорганизмы различного обитания способны выживать в присутствии металлов, однако именно металл-толерантные микроорганизмы отличаются особой устойчивостью к токсическому воздействию металлов. Такие организмы хорошо приспособлены и к широкому диапазону температур, pH, окислительно-восстановительному потенциалу участка, это связано с экстремальными условиями их естественных резервуаров: места залежей руд, гидротермальные источники, близость к действующим вулканам [1, 2].

Молекулярные механизмы, используемые микроорганизмами для выживания в богатых металлами средах, могут быть полезны человеку в различных областях биотехнологии, таких как биоремедиация загрязненных почвы и воды, добыча и обогащение полезных ископаемых. Например, применение металл-толерантных микроорганизмов в бактериально-химическом выщелачивании (БХВ) позволяет извлекать ценные компоненты из низкосортных, бедных руд или отходов горной добычи [3, 4].

В пульпах чанового БХВ концентрации ионов металлов могут превышать природные (например, в рудных месторождениях), они способны как ингибировать активность микробной популяции, угнетая её метаболизм, так и способствовать выработке микроорганизмами устойчивости к повышенным уровням металлов. Используя генетическую и метаболическую основы природных механизмов резистентности к металлам, учёные могут получить улучшенные штаммы биотехнологически значимых микроорганизмов [1, 4].

Большая продолжительность процессов БХВ является существенным недостатком и ставит перед учёными вопрос об интенсификации этих процессов. К вариантам решения данной проблемы относят повышение биоактивности микроорганизмов. Селекция наиболее активных смешанных и чистых культур, адаптированных к условиям протекания БХВ, позволит повысить эффективность извлечения ценных компонентов из сырья [5].

Задачей описанного в статье эксперимента являлась адаптация сообщества аборигенных микроорганизмов сульфидной кобальт-медно-никелевой руды к высоким «промышленным» концентрациям ионов кобальта в питательной среде и наблюдение за окислительной активностью адаптированной культуры. Стояла цель выявить, обладают ли клетки исследуемой культуры микроорганизмов, полученной из рудного месторождения, природными механизмами резистентности к токсическому воздействию кобальта.

Материалы и методы исследования

Эксперимент был проведен с использованием смешанной культуры мезофильных ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов (по данным ПЦР-диагностики НИГТЦ ДВО РАН в составе культуры идентифицированы Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus spp.). Источником культуры служила окисленная сульфидная кобальт-медно-никелевая руда (месторождение Шануч, Камчатский край, Россия). Для данной руды характерно содержание 60–90 % рудных минералов, где основной минерал – пирротин (60–75 %), менее выражены пентландит (20–25 %), виоларит (до 10 %), халькопирит (до 5 %), пирит (3–5 %); содержание Ni 3,9–4,2 %, Co 0,1 %, Cu 0,6–1,0 % (по данным рентгенофлуоресцентного анализа ЗАО НПК «Геотехнология»).

Количественный учёт клеток проводили прямым подсчетом под микроскопом в 10 полях зрения (микроскоп «Микромед-3», увеличение 1000х). Количество клеток в 1 мл среды рассчитывали по формуле

X = Nm•7,56•106, (1)

где X – число клеток в 1 мл, Nm – среднее арифметическое число в m полях зрения, 7,56•106 – коэффициент, рассчитанный с учетом объема анализируемой пробы (2 мкл), площади покровного стекла (576 мм2) и площади поля зрения (0,0132 мм2). В поле зрения микроскопа были видны морфологически однородные полупрозрачные одиночные подвижные палочки.

За окислительной активностью культуры наблюдали путём определения концентраций Fe2+ и Fe3+ в растворах питательной среды методом трилонометрического титрования трилоном Б. Методика определения Fe3+: в коническую колбу объемом 100 мл приливали 30 мл индикаторного раствора (смесь 20 % сульфосалициловой кислоты и 20 % соляной кислоты в дистиллированной воде) и вносили 1 мл анализируемой среды; нагревали до 70 °С на плитке и титровали раствором трилона Б до перехода окраски из красно-фиолетовой в лимонно-желтую и от одной избыточной капли в бесцветную (1 капля = 0,015 мл). Концентрацию Fe3+ (г/л) вычисляли по формуле

CFe3+ = (VТБ•(0,025•55,84)•1000):Vпробы , (2)

где VТБ – мл израсходованного на титрование раствора трилона Б, 0,025 – молярность трилона Б, 55,84 – атомная масса Fe.

Методика определения Fe2+: раствор, в котором оттитровано трехвалентное железо, вновь нагревали до 70 °С, добавляли 50 мг пероксодисульфата аммония (надсернокислого аммония), кипятили в течение 1 мин. Раствор изменял окраску на красно-фиолетовую, после чего его вновь титровали раствором трилона Б до перехода окраски в лимонно-желтую и от одной избыточной капли в бесцветную.

Добавляли несколько кристаллов надсернокислого аммония для проверки полноты окисления (стабильность окраски). Концентрацию Fe2+ вычисляли по той же формуле, что и концентрацию Fe3+.

Адаптация к высоким содержаниям ионов кобальта

Высокие концентрации ионов кобальта были достигнуты добавлением CoSO4•7H2O в состав минеральной питательной среды 9К [6], содержащей FeSO4•7H2O. Был получен ряд концентраций: 12, 14, 16, 18, 20 г/л Co.

В колбы Эрленмейера, где была питательная среда (с) с указанными выше концентрациями ионов кобальта, произвели посев культуры (к) (Nкл. = 1,2•108 кл/мл) в соотношении к:с = 1:10. В том же соотношении культура была внесена в контрольную колбу (К), где содержалась «чистая» среда 9К без ионов кобальта. pH всех сред до посева и культивирования – 1,6.

Посевы культивировали в термостате при 29 °С в течение 5 суток, аэрацию среды осуществляли постоянным перемешиванием с помощью качалки (≈ 110 об/мин). Затем в течение 10 суток культивировали статично (без перемешивания) при комнатной температуре.

Окислительная активность культуры

Окислительную активность исследуемой культуры микроорганизмов рассматривали для образца, адаптированного к 20 г/л ионов Co. На момент окончания адаптации и пересева культуры в «чистую» питательную среду 9К, количество клеток в ней составляло 5,6•107 кл/мл. Источник железа в среде – FeSO4•7H2O. В колбы Эрленмейера произвели посев в соотношении к:с = 1:10, в трех повторениях (Co I, Co II, Co III).

Культивировали в течение 7 суток в термостате (29 °С), аэрацию среды осуществляли перемешиванием на качалке (≈ 110 об/мин) в 0–3 и 6–7 сутки эксперимента.

Результаты исследования и их обсуждение

Адаптация к высоким содержаниям ионов кобальта

Присутствие ионов кобальта в питательной среде 9К в каждой установленной концентрации (12, 14, 16, 18, 20 г/л) не оказало губительного воздействия на рост культуры микроорганизмов; сохранение жизнеспособности указывает на наличие в клетках природных механизмов резистентности к токсическому воздействию кобальта. С ростом культуры первоначальный pH среды повысился с 1,6 до 2,1–2,3 и оставался таким на протяжении всего периода адаптации.

По данным табл. 1 можно видеть, что ионы кобальта ингибировали рост культуры только в начале или первой половине периода адаптации (1 сутки для концентраций Co 12 и 14 г/л; 1–5 сутки для концентраций Co 16 и 18 г/л; 1–9 сутки для концентрации Co 20 г/л) в сравнении с контрольным ростом в чистой питательной среде. Затем численность клеток в адаптируемых образцах превосходила численность контроля.

Таблица 1

Численность клеток культуры в период адаптации к высоким концентрациям ионов кобальта в питательной среде

Концентрация ионов Co, г/л

Количество клеток, •107 кл/мл

1 сутки

3 сутки

5 сутки

7 сутки

9 сутки

11 сутки

13 сутки

15 сутки

К (0)

2,1

4,2

4,6

4,6

4,8

4,8

5,2

5,1

12

0,45

4,6

5,0

5,3

5,9

6,2

6,7

7,0

14

1,7

5,7

5,6

5,9

6,2

6,3

6,8

6,8

16

1,5

1,9

2,6

4,6

4,6

5,1

5,6

5,5

18

0,98

1,9

3,1

4,7

5,2

5,8

5,9

6,3

20

1,1

0,98

2,3

3,1

4,4

5,2

5,6

6,5

Для дальнейшего хода исследования (наблюдения за окислительной активностью микроорганизмов) был выбран образец, адаптированный к 20 г/л ионов Co, как устойчивый к самой высокой заявленной концентрации.

Окислительная активность культуры

В «чистой» питательной среде 9К адаптированная культура показывала медленный рост по сравнению с контролем в первые и вторые сутки эксперимента, уже к третьим суткам рост превысил контрольные показатели. К окончанию эксперимента (7 сутки) численность клеток контрольной культуры превосходила численность адаптированной (табл. 2, рис. 1). Показатель pH сохранялся в пределах 2,1–2,3.

Таблица 2

Численность клеток адаптированной культуры в «чистой» питательной среде 9К

Сутки

Количество клеток, •107 кл/мл

К

Co I

Co II

Co III

1

0,68

0,60

0,30

0,30

2

0,50

0,50

0,83

0,50

3

0,84

2,19

1,82

1,63

6

1,74

3,34

1,52

2,12

7

4,02

3,41

2,58

1,90

chomch1.tif

Рис. 1. Численность клеток адаптированной культуры в «чистой» питательной среде в сравнении с контролем

chomch2.tif

Рис. 2. Изменения концентрации Fe3+ (г/л) в питательной среде с адаптированной культурой в сравнении с контролем

chomch3.tif

Рис. 3. Изменения концентрации Fe2+ (г/л) в питательной среде с адаптированной культурой в сравнении с контролем

Результаты измерений концентраций Fe3+ и Fe2+ представлены на рис. 2 и 3 соответственно; скорость окисления железа адаптированной культурой значительно превышала скорость окисления контрольной, вероятно, это связано с лучшим ростом клеток в первом случае. Однако для образца Co III характерно небольшое увеличение количества клеток в 3–7 сутки эксперимента, в то же время скорость окисления выше, чем у всех остальных образцов.

Необходимо отметить: несмотря на разницу в скоростях окисления адаптированной и контрольной культурами, железо питательного раствора (Fe2+) было окислено (до Fe3+) полностью или почти полностью к седьмым суткам эксперимента (рис. 3).

Заключение

Полученные экспериментальные данные позволяют сделать следующие выводы:

– исследованная смешанная культура мезофильных ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов (включающая Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus spp.) оставалась жизнеспособной и сохраняла рост в среде с добавлением ионов кобальта в диапазоне концентраций 12–20 г/л, вероятно клетки данной культуры обладают природными механизмами резистентности к токсическому воздействию кобальта в высоких концентрациях;

– в период адаптации к присутствию ионов кобальта в питательной среде культурой не была утрачена или ослаблена способность к окислению железа, напротив, скорость окисления такой культурой была выше контрольной, не подвергавшейся воздействию высоких концентраций ионов кобальта;

– несмотря на меньшую численность клеток на протяжении почти всего эксперимента и более низкую скорость окисления в сравнении с адаптированной культурой, контрольная культура «завершила» окисление всего доступного железа питательного раствора к седьмым суткам эксперимента, одновременно с адаптированной культурой.

Необходимо продолжать исследования полезного биотехнологического потенциала адаптированной культуры, интересным представляется опыт использования данной культуры в качестве биологического компонента чанового БХВ, потенциально интенсифицирующего биовыщелачивание металлов.


Библиографическая ссылка

Хомченкова А.С. ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ КУЛЬТУРЫ АЦИДОФИЛЬНЫХ ХЕМОЛИТОТРОФОВ, АДАПТИРОВАННЫХ К ВЫСОКОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ КОБАЛЬТА // Успехи современного естествознания. – 2018. – № 11-2. – С. 230-234;
URL: https://natural-sciences.ru/ru/article/view?id=36931 (дата обращения: 24.10.2021).

Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
(Высокий импакт-фактор РИНЦ, тематика журналов охватывает все научные направления)

«Фундаментальные исследования» список ВАК ИФ РИНЦ = 1.074